micro

BAB I

PENDAHULUAN

A.     Latar Belakang Pelaksanaan Praktik Kerja Industri

      Pada masa globalisasi seperti sekarang ini, manusia dituntut untuk dapat bekerja agar kebutuhan hidupnya terpenuhi. Pekerjaan yang ada khususnya di industri telah mengalami perubahan mengarah kepada trend globalisasi. Dengan adanya trend globalisasi ada pekerjaan, mengakibatkan terjadinya persaingan yang ketat untuk mendapatkan pekerjaan, untuk itu diadakan program Praktik Kerja Industri. Praktik Kerja Industri merupakan pendidikan pelatihan kerja secara nyata di industri, Praktik Kerja Industri dimaksudkan agar siswa mendapatkan berbagai pengalaman kerja di era sekarang ini. Bidang pekerjaan yang dipelajari difokuskan pada ilmu tekhnologi pengolahan hasil pertanian dimana masyarakat sekarang pada umumnya menginginkan makanan yang praktis (siap saji), untuk itu sekarang banyak perusahaan makanan dan minuman berlomba-lomba untuk bersaing dengan memproduksi makanan dan minuman dengan inovasi terbaru agar konsumen tidak lari karena jenuh dengan makanan atau minuman yang sudah ada. Namun apakah semua perusahaan masih mengutamakan gizi dan keamanan pangan yang diproduksi, untuk itu teknologi pangan sangat perlu dikembangkan.

      Karena pentingnya keamanan pangan, maka ilmu yang berhubungan dengan kualitas dan keaman pangan perlu dipelajari. Pada laporan ini mengutamakan tentang mikrobiologi pangan, dimana pada HACCP faktor utama yang harus diperhatikan pada produk makanan atau minuman adalah faktor yang berhubungan dengan mikroorganisme. Pada laporan ini akan dibahas tentang pengujian mikrobiologi yang sering dilakukan pada produk makan dan minuman dan segala ruang lingkup yang ada dalam pengujian mikrobiologi pangan.

B.     Uraian Tujuan Praktik Kerja Industri

Tujuan Praktik Kerja Industri pada intinya adalah menerapkan dan memantapkan pengetahuan baru yang di dapat selama mengikuti program tersebut. Adapun tujuan praktik kerja industri secara luas meliputi :

1.      Menambahkan wawasan serta pandangan siswa tentang ruang lingkup kerja, terutama aspek-aspek yang potensial dalam dunia keja, antara lain: struktur organisasi, disiplin, lingkungan dan sistem kerja.

2.      Meningkatkan pengetahuan siswa dalam hal penggunaan instrumen yang berhubungan dengan teknologi pengolahan hasil pertanian dan kimia analis yang lebih moderen dibanding dengan fasilitas yang tersedia disekolah.

3.      Memberi pelatihan kepada siswa untuk mendewasakan mental, meningkatkan kemampuan dan memanfaatkan bakat/keterampilan sesuai dengan sasaran kejuruan.

4.      Memberikan kesempatan kepada siswa untuk berbaur diri dalam suasana kerja yang sebenarnya, baik sebagai tenaga kerja maupun sebagai pekerja mandiri terutama yang berkenaan dengan masalah disiplin kerja.

5.      Memperoleh masukan dan umpan balik guna memperbaiki dan mengembangkan sesuai pendidikan kejuruan.

6.      Menumbuhkembangkan dan memantapkan sikap profesional siswa dalam rangka memasuki lapangan kerja.

7.      Memberikan peluang masuk untuk penempatan kerja.

Kegiatan praktik kerja industri ini dapat dilaksanakan disuatu instansi atau perusahaan yang menggunakan tenaga analis sebagai pegawainya pada bagian tertentu. Setelah melaksanakandan menyalesaikan praktik kerja industri ini, setiap siswa diwajibkan membuat laporan hasil kerjanya, yang bertujuan untuk:

1. Mengumpulkan data, baik untuk kepentingan sekolah maupun untuk kepentingan pribadi dan perusahaan.
2. Siswa mampu mencari alternatif pemecahaan masalah secara lebih luas dan mendalam.
3. Siswa mampu memahami, memantapkan dan mengembangkan pelajaran yang didapat disekolah serta penerapannya di dalam dunia kerja.
4. Menambahkan perbendaharaan kepustakaan yang menunjang peningkatan pengetahuan siswa.

C.     Sistematika Laporan

   Laporan praktik kerja industri ini dibagi dalam beberapa bagian yang disusun sebagai berikut:

1.      Bagian pertama

a.    Lembar judul

b.    Lembar ersetujuan pembimbing dan pengesahan kepala sekolah

c.    Lembar motto

d.    Lembar persembahan

e.    Riwayat hidup penulis

f.      Kata pengantar

g.    Daftar isi

h.    Daftar gambar

i.      Daftar tabel

j.      Daftar lampiran

2.      Pendahuluan

a.    Latar belakang pelaksanaan praktik kerja industri

b.    Uraian tujuan praktik kerja industri

c.    Sistematika laporan praktik kerja industri

3.      Institusi tempat praktik kerja industri

a.    Jati diri SEAFAST Center

b.    Struktur organisasi

c.    Tugas dan fungsi

d.    Fasilitas dan sarana

e.    Kegiatan

f.      Administrasi laboratorium

g.    Disiplin kerja

h.    Keselamatan dan kesehatan kerja

4.      Kegiatan di laboratorium

5.      Pembahasan

6.      Penutup

7.      Daftar pustaka

8.      Lampiran

BAB II

INSTITUSI PERUSAHAAN

A.     Jati Diri SEAFAST Center

      Di Institut Pertanian Bogor (IPB) program pendidikan dan penelitian di bidang pangan dan gizi telah dikembangkan sejak lebih dari 30 tahun yang lalu. Untuk mendukung tridharma perguruan tinggi, khususnya di bidang pangan dan gizi, IPB memiliki beberapa pusat yang relevan dengan  bidang pangan dan gizi.

      Pada tahun 1975 Pusat Pengembangan Teknologi Pangan (Pusbangtepa) atau Food Technology Development Center (FTDC) didirikan di IPB. Sarana untuk pusat ini dibangun dengan dana dari Bank Dunia. Pada tahun 1985 dengan dana dari Bank Dunia, IPB mendirikan Pusat Antar Universitas (PAU) atau Inter University Center (IUC). Dalam perkembangan berikutnya, pada tahun 1992 PAU dikembangkan menjadi Pusat Studi Pangan dan Gizi (PSPG) atau Center for Food and Nutrition Studies (CFNS). Pusat-pusat lainnya yang relevan dengan pangan dan gizi yang dikembangkan di IPB adalah Pusat Studi dan Kajian Pangan dan Gizi (PSKPG) atau Food and Nutrition Policy Studies (CFNPS) yang dikembangkan pada tahun 1987 dan Pusat Kajian Makanan Tradisional (PKMT) atau Center for Assessment of Tradisional Food (CATF) yang dikembangkan pada tahun 1997.

      Sejak tahun 2003, IPB melakukan proses reorganisasi dan konsolidasi pusat-pusat yang ada di IPB untuk lebih mengefisiensikan dan memperjelas mandat masing-masing pusat.  Dengan reorganisasi dan konsolidasi ini, pada tahun 2004 seluruh pusat-pusat yang relevan dengan bidang pangan dan gizi dikonsolidasikan menjadi satu pusat yang disebut Pusat Ilmu dan Teknologi Pangan dan Pertanian Asia Tenggara atau Southeast Asian Food and Agricultural Science and Technology (SEAFAST) Center.

      Sehingga saat ini di IPB hanya terdapat satu pusat yang terkait dengan pangan dan gizi yaitu SEAFAST Center.

B.     Visi, Misi dan Rencana Strategi Pengembangan

      SEAFAST Center telah menetapkan visi sebagai pusat penelitian yang terkemuka dalam bidang mutu, gizi dan keamanan pangan di Asia Tenggara. SEAFAST Center dikembangkan untuk membangun sistem kerjasama nasional dan regional dalam pengembangan bidang ilmu dan teknologi pangan dan pertanian. IPB telah memberikan mandat kepada SEAFAST untuk menjadi pusat regional yang berfokus pada peningkatan mutu, gizi dan kemanan pangan melalui ilmu dan teknologi.  Oleh karena itu, SEAFAST Center telah menetapkan misi sebagai berikut:

ü      Mengembangkan program-program pendukung untuk mempercepat pertumbuhan pertanian sehingga dapat meningkatkan nilai tambah produk pertanian dan meningkat daya saing Indonesia

Memberdayakan universitas, pemerintah, penyandang dana dan sektor bisnis untuk bersama-sama mengembangkan ilmu dan teknologi pangan di Indonesia dan ASEAN

Dalam rangka mencapai target menjadi pusat regional, SEAFAST Center telah menetapkan 4 (empat) strategi untuk mencapai visi dan melaksanakan misi SEAFAST Center, yaitu:

1.      Public policy guidance and coordination

Program-program yang perlu dikembangkan antara lain adalah:

1)          Analisis kebijakan dan rekomendasi untuk memperbaiki kaitan antara makro ekonomi dengan sektor pertanian dan industri untuk mencapai respon dan koordinasi yang optimal.

2)          Analisis dan rekomendasi yang terkait dengan strategi pengembangan perdagangan dan negosiasi yang mencerminkan kapasitas nasional serta meningkatkan daya saing

3)          Panduan untuk meningkatkan keuntungan komparasi nasional dan daya saing.

4)          Memobilisasi dan mengkoordinasikan sektor privat, pemerintah dan donor untuk mendukung pengembangan sistem teknologi yang diperlukan pasar dan pengelolaan sumberdaya yang berkelanjutan.

2.      Pelatihan dan pengembangan kapasitas

Program-program yang perlu dikembangkan antara lain:

1)          Peningkatan keahlian dalam pengelolaan bisnis dan penciptaan pasar yang meliputi pengembangan business plan, pengembangan produk, dan strategi pemasaran.

2)          Pelatihan dalam bidang produksi dan penanganan pasca panen serta pemanfaatan lahan yang dapat meningkatkan pendapatan, nilai tambah dengan fokus pada produksi pangan berkualitas tinggi.

3)          Praktek-praktek untuk meningkatkan keamanan pangan dan hewan, serta persyaratan fitosanitari serta sistem sertifikasinya.

4)          Analisis pasar dan bisnis sehingga dapat mendukung penyiapan sarjana dalam bidang agribisnis.

5)          Pelatihan-pelatihan terapan untuk topik dan audien tertentu yang meliputi pembuat kebijakan, praktisi dan mahasiswa, aplikasi ICT, training for trainer untuk LSM dengan prioritas pada peningkatan kapasitas.

6)          Mendukung pelaksanaan program-program pasca sarjana di bidang pertanian secara umum.

3.      Pengembangan riset teknologi terapan

Teknologi-teknologi yang perlu dikembangkan antara lain:

1)          Teknologi yang relevan dengan penanganan pasca panen, pengolahan pangan dan penjaminan keamanan pangan.

2)          Strategi alternatif pemanfaatan lahan dengan dukungan agronomi yang tepat untuk mendukung diversifikasi sehingga dapat meningkatkan daya saing dan nilai tambah.

3)          Teknologi untuk perbanyakan bibit terutama untuk mendukung pengembangan buah-buahan, sayuran, peternakan dan perikanan.

4)          Mengembangkan program yang mendukung pasar yang responsif misalnya melalui organisasi komoditi dan perdagangan, bisnis inkubator dan strategi pengembangan bisnis.

5)          Mendisain program-program baru dan memperkuat jaringan internasional, nasional dan lokal untuk mendukung penelitian dan pengembangan.

4.      Awareness enhamcement and sector advocacy services

Program-program yang dapat dikembangkan meliputi:

1)          Penyiapan materi-materi untuk advokasi yang mencakup white paper yang disampaikan kepada para pembuat kebijakan. Pelaku bisnis dan pimpinan pemerintah yang relevan dengan bidang pertanian.

2)          Mengembangkan materi-materi promosi untuk menunjukkan pada komuniti nasional dan internasional mengenai pentingnya agenda pengembangan pertanian.

3)          Penggunaan media masa untuk promosi hal-hal yang terkait dengan pertanian.

      Strategi tersebut akan dilaksanakan secara bertahap.  Sebagai acuan dalam perlaksanaan strategi, SEAFAST telah menetapkan 4 (empat) fokus fokus pengembangan untuk kurun waktu lima tahun ke depan sebagaimana tertuang di dalam Rencana Strategis 2005-2010 (Five Year Strategic Planning), yaitu:

1. Pengembangan program perbaikan gizi

Tujuan dari program ini adalah meningkatkan kontribusi SEAFAST Center dalam meningkatkan status gizi masyarakat. Program ini terdiri dari kegiatan penelitian dan kajian yang terkait dengan konsumsi pangan, status gizi dan intrevensi gizi; pengembangan model-model intervensi gizi dan pengembangan masukan untuk penetapan kebijakan yang terkait dengan intervensi gizi, dan memberikan pendidikan kepada masyarakat dalam rangka peningkatan status gizi dan intervensi gizi.

2. Peningkatan mutu dan kemanan pangan

Tujuan program ini adalah meningkatkan kontribusi SEAFAST Center dalam memperbaiki kualitas dan keamanan pangan di Indoneisa melalui penelitian, advokasi berbasis ilmu pengetahuan, dan alih teknologi. Program ini mencakup penelitian dasar dan terapan untuk memperbaiki kualitas dan keamanan pangan, kajian resiko keamanan pangan, pengembangan panduan-panduan untuk mengurangi resiko keamanan pangan dari tingkat petani sampai konsumen, membuat rekomendasi-rekomendasi untuk penetapan kebijakan, mengembangkan kurikulum untuk pendidikan keamanan pangan dan memberikan pendidikan kepada masyarakat dalam rangka peningkatan keamanan pangan.

3. Pengembangan program ketahanan pangan

Tujuan program ini adalah mengembangkan SEAFAST Center sebagai institusi rujukan dalam mengembangkan ketahanan pangan berbasis sumberdaya lokal.  Program ini meliputi kegiatan penelitian dan pengembangan teknologi dan rekayasa yang sesuai dengan sumberdaya indigenus untuk mendukung ketahanan pangan, advokasi kebijakan dan aksi untuk ketahanan pangan, dan pengembangan kemitraan industri dalam menunjang komersialisasi hasil penelitian untuk mendukung ketahanan pangan.

4. Pengembangan program peningkatan daya saing produk

Tujuan program ini meningkatkan peran SEAFAST Center dalam meningkatkan daya saing produk pangan berbasis lokal atau tradisional melalui pemebrian informasi, teknologi, promosi, pengembangan standar pangan dan kebijakan, serta pengembangan sumberdaya.

Program ini mencakup kegiatan-kegiatan kajian state of the art produk pangan potensial, perbaikan kualitas produk pangan lokal atau tradisional, studi kebijakan yang terkait dengan penjaminan kualitas dan keamanan pangan produk impor pada entry point, promosi produk pangan lokal/tradisional dan pengembangan panduan untuk analisis resiko impor, mengembangkan sistem informasi berbasis web mengenai penelitian, teknologi dan perdagangan serta memberikan pelatihan-pelatihan untuk memperbaiki sistem inspeksi pada entry dan exit point untuk produk impor/expor.

C.     Struktur Organisasi

      Jumlah pegawai SEAFAST Center ada 77 orang yang terdiri dari 8 pemimpin bagian, 30 peneliti dan 39 Staf pendukung (laboratorium dan administrasi). Struktur organisasi SEAFAST Center mengacu pada pedoman pembuatan dan pengaturan perusahaan yang telah ditetapkan oleh pemerintah. Untuk lebih jelasnya, struktur organisasi SEAFAST Center dapat dilihat pada Lampiran 2.

D.    Tugas dan Fungsi

      SEAFAST Center sebagai lembaga penelitian dan pemberdayaan masyarakat mempunyai tugas dan fungsi sebagai berikut :

1.      Memberikan pelayanan jasa laboratorium.

2.      Melakukan penelitian dan pelayanan jasa dibidang peningkatan kualitas dan keamanan pangan, R&D, diversifikasikan pangan, pengemasan dan pelabelan, peningkatan paska panen dan ketahanan pangan, kualitas pangan, pendidikan keamanan dan gizi pangan.

E.     Fasilitas dan Sarana

      Fasilitas utama menjalankan tugas dan fungsi SEAFAST Center diantaranya adalah :

1.      Laboratorium analisis beserta seluruh kelengkapanya. Laboratorium tersebut antara lain:

a.       Laboratorium Kualitas dan Keamanan Pangan (Mikrobiologi dan Kimia)

b.      Laboraatorium  Bioteknologi Pangan

c.       Laboratorium Analisis Mikrobiologi Pangan

d.      Laboratorium Fermentasi Bakteri

e.       Laboratorium Uji pada Hewan

f.        Laboratorium Organoleptik

g.       Pilot plant untuk Minyak dan Lemak

h.       Pilot plant untuk Pengolahan Makanan

2.      Alat- alat dan mesin yang canggih dan modern

3.      Komputer

4.      Tenaga Ahli

5.      Distance Learning Education Classroom

F.      Administrasi Laboratorium

      Karena SEAFAST Center merupakan pusat Ilmu Teknologi Pangan dan Pertanian Asia Tenggara maka SEAFAST Center sering melayani kegiatan jasa laboratorium (khususnya pada analisis mikrobiologi). Adapun prosedur yang harus dilalui untuk setiap sampel yang masuk adalah sebagai berikut :

1.      Konsumen menyerahkan sampel yang akan diperiksa kepada petugas penerima penerima sampel

2.      Kemudian sampel diperiksa oleh manager teknik untuk dikaji ulang jika disetujui konsumen melengkapi administrasi yang ada kepada petugas penerima sampel dan administrasi.

3.      Petugas penerima contoh melakukan pendataan sampel (penanganan dan pengkodean sampel) kemudian sampel yang telah dikode diserahkan kepada supervisor analisis.

4.      Supervisor analisis mendistribusikan kepada analis laboratorium untuk diuji sesuai  dengan analisa yang diminta oleh konsumen.

5.      Setelah analisis selesai menguji sampel hasil akan dilaporkan kepada supervisor analisis yang kemudian diserahkan ke manager teknik untuk diperiksa dan disetujui.

6.      Hasil analisis yang telah disahkan kemudian dinyatakan dalam bentuk sertifikat yang ditandatangani oleh manager teknik.

7.      Dilanjutkan pengiriman kepada konsumen dan penyelesaian administrasi yang ditandatangani oleh petugas penerima contoh  dan bagian administrasi.

G.    Disiplin Kerja

      SEAFAST Center menetapkan 5 hari kerja dalam satu minggu, yaitu dari hari senin sampai hari jum’at. Jam kerja di SEAFAST Center mulai pukul 08.00 hingga 16.00 WIB, dengan waktu istirahat selama 1 jam mulai pukul 12.00 hingga pukul 13.00 WIB untuk hari senin sampai hari kamis sedangkan untuk hari jum’at waktu istirahat 90 menit dimulai pukul 11.30 hingga 13.00 WIB. Jam kerja diakhiri pukul 16.30 WIB. Jumlah jam kerja seminggu sesuai dengan ketentuan departemen tenaga kerja yaitu 40 jam seminggu. Untuk meningkatkan disiplin kerja, setiap karyawan memiliki kartu jam kerja sehingga perusahaan dapat mengetahui jam masuk dan keluar karyawan  kantor.

      Peraturan dibuat dalam bentuk kesepakatan kerja bersama (KKB) yang ditandatangani oleh pihak manajemen dan pihak pengurus unit kerja FSPS I (Federasi Serikat Pekerja Seluruh Indonesia). Ketentuan-ketentuan lain yang menyangkut ketenagakerjaan disesuaikan dengan ketentuan yang berlaku di indonesia.

H.    Keselamatan dan Kesehatan Kerja

      Para pekerja yang bekerja di tempat-tempat berbahaya diwajibkan untuk memakai alat-alat keselamatan kerja seperti jas leb, masker, sarung tangan dan lain sebagainya. Serta dalam pelaksanaan pengujian dilakukan dengan mengikuti GLP (Good Laboratorium Practice) dan prosedur standar. Juga terdapat alat-alat keselamatan dan kesehatan yang tersedia seperti pemadam kebakaran, ketersediannya safety box dalam setiap ruang.

BAB III

KEGIATAN DI LABORATORIUM

               Selama praktik kerja industri di SEAFAST Center penulis ikut melakukan beberapa pengujian seperti pengujian TPC (Total Plate Count), kapang dan khamir, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella, Coliform, kultur mikroba, pembuatan kultur kapang pada gelas obyek (Slides Culture). Penulis juga sempat mengikuti pelatihan di SEAFAST Center sebagai peserta pada tanggal 18 juli 2011, adapun macam kegiatan yang dilakukan adalah sanitasi, pewarnaan mikroba, pengawetan kultur Salmonella dan beberapa pengujian yang dilakukan sehari-hari. Berikut penjelasan dari setiap kegiatan yang dilakukan.

A.     Sanitasi

      Sanitasi merupakan upaya yang dilakukan untuk menjamin terwujudnya kondisi yang memenuhi persyaratan kesehatan. Dapat juga didefinisikan sebagai perilaku yang disengaja dalam pembudayaan hidup bersih dengan maksud mencegah manusia bersentuhan secara langsung dengan kotoran dan bahan buangan lainya dengan harapan usaha ini dapat menjaga dan meningkatkan kesehatan manusia. Bahaya ini mungkin bisa terjadi secara fisik, mikrobiologi dan agen-agen kimia atau biologis dari penyakit terkait.

Dalam pengujian mikrobiologi dilakukan secara aseptis, dimana aseptis merupakan kondisi steril yang biasa diterapkan pada proses pengujian, pada proses pengujian secara aseptis, bahan (medium/pengencer), alat, serta personelnya harus dalam kondisi steril. Sterilisasi alat dan bahan dapat dilakukan menggunakan autoklaf  pada suhu 121ºC selama 15 menit. Untuk menjaga kebersihan dan keakuratan dalam pengujian mikrobiologi, laboratorium mikrobiologi melakukan sanitasi yang terdiri dari 3 aspek, yaitu :

1.      sanitasi ruang

2.      sanitasi pekerja

3.      sanitasi alat.

Pada setiap kegiatan sanitasi, dikenal 4 tahap penting yang harus dilaksanakan yaitu: pembasahan, pelarutan, pembilasan, dan sanitizing (kegiatan saniter).

Pembasahan, pelarutan dan pembilasan biasa dilakukan pada sanitasi ruangan yang  meliputi lantai, dinding, langit-langit, dan jendela. Sedangkan saniter  dapat digunakan untuk membersihkan alat-alat gelas atau alat-alat lain yang digunakan dilaboratorium.

      Kegiatan pencucian biasanya meliputi pembasahan, pelarutan dan pembilasan. Kegiatan pembasahan dapat menggunakan air dingin, air panas apabila jenis pengotor dapat larut dengan air, apabila jenis pengotor dari jenis lemak atau minyak maka menggunakan khlorofrom atau alkohol. Dalam pelarutan biasanya menggunakan sabun atau deterjen yang dapat melarutkan sisa kotoran maupun sisa lemak sisa kotoran.

B.     Kerja Aseptis

 

     

                  Gambar 1. kabinet biosafety (Laminar flow)

      Teknik aseptis atau steril adalah suatu sistem cara bekerja (praktek) yang menjaga sterilitas ketika menangani pengkulturan mikroorganisme untuk mencegah kontaminasi terhadap kultur mikroorganisme yang diinginkan.

      Dasar digunakan teknik aseptik adalah adanya banyak partikel debu yang mengandung mikroorganisme (bakteri atau spora) yang mungkin dapat masuk ke dalam cawan, mulut erlenmeyer, atau mengendap di area kerja. Pertumbuhan mikroba yang tidak diinginkan ini dapat mempengaruhi atau mengganggu hasil dari suatu percobaan. Mikroorganisme dapat juga ”jatuh” dari tangan analis, sarung tangan atau jas laboratorium karena pergerakan lengan yang relatif cepat. Penggunaan teknik aseptik meminimalisir material yang digunakan terhadap agen pengontaminasi. Pada kenyataanya teknik aspetis tidak dapat melindungi secara sempurna dari bahaya kontaminan. Namun semakin banyak belajar dari pengalaman maka semakin mengurangi resiko yang ditimbulkan.

Teknik aseptis digunakan pada saat :

·  Teknik aseptis seharusnya digunakan saat kita bekerja dengan mikroorganisme hidup dan dengan segala media pertumbuhannya.

·  Teknik aseptis sebaiknya digunakan ketika kita tidak ingin larutan dari suatu botol tidak berubah sifat akibat aktivitas mikroorganisme, seperti saat membuat buffer meskipun buffer dengan konsentrasi garam tinggi atau mengandung deterjen.

·  Teknik aseptis disarankan pada saat kita bekerja menggunakan agen atau senyawa yang berbahaya seperti bahan kimia beracun atau bahan radioaktif. Tentu saja perlindungan diri sendiri dari bahaya senyawa ini lebih penting.

Beberapa contoh Kerja aseptis :

·  Mentransfer biakan dari media satu ke media lainnya. Bakteri kontaminan yang tumbuh tentu saja dapat mengganggu kemurnian biakan dan mungkin saja membuat rancu hasil yang didapatkan.

·  Memfilter media atau serum dan menghitung jumlah bakteri dengan cara filtrasi. Kontaminasi yang ikut tersaring dapat tumbuh pada media baru yang membuat tidak terpakainya media pertumbuhan tersebut atau mempengaruhi jumlah total bakteri.

·  Membuka dan merehidrasi bakteri terliofolisasi. Teknik aseptis dapat menjaga sel yang terrehidrasi dari bakteri kontaminan dan menjaga tidak keluarnya sel ke meja kerja.

·  Melabeli sel dengan (32P) fosfat. Pada kasus ini kerja aseptis ditujukan untuk melindungi analis dari bahan kimia berbahaya. Jika menggunakan teknik aseptis maka Anda tidak akan membiarkan tutup bahan radioaktif terbuka atau secara tidak sengaja menggunakan pipet bekas bahan radioaktif.

Aturan umum teknik aseptis:

·  Meja kerja sebaiknya jauh dari sesuatu yang dapat menciptakan aliran udara, misalnya tidak ada jendela yang terbuka, tidak dekat dengan pintu yang selalu dibuka-tutup dan jauh dari lalu-lintas orang. Penggunaan kabinet biosafety (Laminar flow)  dapat menjaga dan mengatur aliran udara tetapi ini bukan merupakan suatu jaminan mutlak dari resiko terkontaminasi.

·  Pastikan meja kerja bersih dari kotoran dan benda-benda yang tidak akan digunakan. Kultur tua atau pipet bekas seharusnya tidak berada di meja kerja. Kotoran seringkali sulit dibersihkan pada sudut-sudut ruang.

·  Usap meja kerja dengan antiseptik atau senyawa pembersih lain sebelum digunakan. Di sebagian besar laboratorium umumnya menggunakan etanol 70% untuk membersihkannya. Sediakan etanol pada posisi selalu dekat dengan meja. Jika telah selesai bekerja, sebaiknya meja kerja dikosongkan dari peralatan dan bersihkan lagi.

·  Semua peralatan (pipet, cawan dll.) yang digunakan harus steril. Sebaiknya semua peralatan yang telah disterilisasi diberi label. Jika menemukan alat yang sepertinya telah disterilisai tapi masih ragu terhadap sterilitasnya maka sebaiknya jangan digunakan. Bungkus peralatan baik alat steril sekali pakai atau bukan (pipet, syringe dll.)diperiksa terlebih dahulu apakah terdapat kebocoran atau tersobek.

·  Atur peralatan di meja kerja sedemikian rupa sehingga meminimalisir pergerakan tangan. Alat-alat yang biasanya digunakan dengan tangan kanan (jarum inokulum, filler, pipet dll.) letakkan disebelah kanan begitu juga sebaliknya (rak tabung, cawan petri, erlenmeyer dll.) terkecuali untuk tangan kidal. Di bagian tengah meja kerja disediakan ruang lapang untuk bekerja.

·  Membakar mulut atau bagian tepi dari suatu alat dapat membunuh mikroorganisme yang menempel.

·  Telah siap dengan segala peralatan dan bahan yang dibutuhkan. Semua bahan dan alat untuk prosedur tertentu telah dipersiapkan di meja kerja. Jangan sampai meninggalkan meja kerja untuk mengambil sesuatu yang terlupa atau tertinggal. Perhitungkan semua yang diperlukan beserta cadangannya.

·  Pakai sarung tangan lateks dan ganti secara berkala. Sarung tangan membantu melindungi dari tumpahan biakan atau bahan kimia berbahaya. Tidak menggunakan sarung tangan dirasa tidak bermasalah jika materi dan bakteri yang diteliti dipastikan tidak berbahaya.

·  Cuci tangan sebelum dan sesudah bekerja. Cuci tangan dengan desinfektan atau sabun bila tidak ada desinfektan. Cuci tangan dapat membilas mikroorganisme yang ada di tangan.

C.     Uji Densitas Mikroba di Ruangan dan Laminar

a.      Densitas mikroba diruang

      Udara secara alami tidak mengandung organisme, tetapi kontaminasi dari lingkungan sekitar mengakibatkan udara mengandung organisme misalnya: proses aerasi, debu, air, dari penderita saluran infeksi dan lain-lain. Mikroorganisme diudara biasanya melekat  pada bahan padat mikro misalnya debu, tetesan air dari sisa praktikum atau sanitasi air yang tidak lancar. Apabila didalam sebuah laboratorium terdapat banyak debu dan cairan, maka mikroba yang ditemukan di dalamnya juga bermacam-macam termasuk bakteri, kapang ataupun khamir.

      Mikroorganisme didalam ruang analisa dapat diuji secara kuantitatif menggunakan agar  cawan yang dibiarkan terbuka selama beberapa waktu tertentu didalam ruangan yang sering digunakan untuk analisa. Jenis mikroorganisme yang sering terdapat diudara pada umumya berasal dari jenis bakteri batang pembentuk spora, baik yang bersifat aerobik maupun  anaerobik contoh bakteri gram negatif, bakteri koki, kapang dan khamir.

a.    Tujuan:   Kegiatan ini dilakukan untuk memantau kondisi sanitasi dengan melihat                                                                                                                                        jumlah mikroba dalam ruang persatuan luas dan satuan waktu tertentu (densitas mikroba).

b.    Cara kerja :

1)      Digunakan media PCA padat pada cawan petri sebanyak jumlah titik yang akan diamati

2)      Media PCA tersebut diletakan dalam beberapa titik di dalam ruangan (minimal   4 titik)

3)      Dibuka selama 15 menit

4)      Ditutup kembali dan diinkubasikan pada suhu 35°C selama 2 hari (cawan dalam posisi terbalik)

5)      Hitung setiap koloni yang ada dalam setiap cawan

6)      Dibuat rata-rata jumlah koloni

7)      Hitung densitas mikroba (koloni/m².jam) ruang dengan rumus:

Densitas mikroba = Rata-rata jumlah koloni x 10.000 x 60 menit

                                              Luas cawan (cm²)      15 menit

Keterangan : jari-jari cawan petri = 4,5 cm²

b.Densitas Mikroba  Laminar

      Seperti halnya ruang analisa, laminar juga perlu melakukan pengujian densitas mikroba untuk mengetahui seberapa banyak mikroba yang terdapat dalam laminar. Laminar lebih rentang terhadap mikroba karena laminar tempat analisa berlangsung, sehingga memungkinkan mikroba yang sedang diuji  secara tidak sengaja  keluar atau jatuh dari tempat sampel. Contoh, pada saat pengujian kapang dan khamir, spora keluar dari tempat sampel dan menempel di dinding laminar sehingga pada saat pengujian beralangsung dapat mengakibatkan kontaminasi.

a.    Tujuan: Dilakukan untuk memantau kondisi sanitasi laminar dengan melihat jumlah mikroba dalam ruang  persatuan luas dan satuan waktu tertentu (densitas mikroba)

b.   Pembuatan media

Dibuat Plate Count Agar (PCA) dengan cara menimbang media PCA bubuk sesuai dengan kebutuhan, dilarutkan dengan aquadest sesuai volume yang diinginkan, dipanaskan sampai larut, disterilisasi menggunakan autoklaf selama 15menit pada temperatur 121°C, dituang dalam cawan petri steril ± 15 ml biarkan memadat.

c.         Prosedur

1)   Pengujian densitas microba dilakukan pada 3 waktu yaitu: (1) Sebelum di Ultraviolet (desinfeksi), (2) Setelah di UV, dan (3) Saat dilakukan analisis.

2)   Media PCA pada cawan petri diatas digunakan sesuai dengan jumlah titik yang akan di amati (5 titik) pada laminar.

3)   Media PCA tersebut di simpan pada 5 titik dilaminar

 

                                                                         

Ganmbar 1. Cara penempatan media PCA dalam laminar.

D.    Persiapan Media dan Sampel

a.      Persiapan media

      Pupukan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroba dilaboratorium disebut media (tunggal) atau media (jamak). Media dibedakan atas tiga macam yaitu :

1)      Media cair yang dapat digunakan untuk berbagai tujuan termasuk menumbuhkan dan membiakkan mikroba, fermentasi, dan uji-uji lainnya, misalnya Nutrient Broth, Glucose Broth, dan lain sebagainya.

2)      Media padat, misalnya Nutrient Agar, Plate Count Agar atau Potato Dextrose Agar, yang dapat digunakan untuk menumbuhkan mikroba pada permukaan sehingga membentuk koloni yang dapat dilihat, dihitung atau diisolasi.

3)      Media setengah padat (semi solid) yang mempunyai konsistensi diantara media cair dan media padat. Media semi solid biasa digunakan untuk menumbuhkan bakteri asam laktat atau bakteri Bal.

b.      Komposisi media

      Untuk menstimulir pertumbuhan mikroba, media yang digunakan harus mengandung komponen-komponen yang dibutuhkan mikroba tersebut. Kebutuhan dari mikroba termasuk air, karbon, energi, nitrogen, mineral dan faktor pertumbuhan lain seperti vitamin dan beberapa asam amino. Mikroba juga mempunyai pH minimum dan pH maksimum dan optimum untuk pertumbuhanya, oleh karena itu dalam persiapan media perlu dilakukan pengukuran pH sehingga tercapai pH optimum untuk mencapai pertumbuhan mikroba yang diinginkan.

      Media yang dipersiapkan dengan mencampurkan komponen-komponen kimia murni dalam jumlah tertentu sehingga komposisinya dapat diketahui dengan pasti disebut media sintetik. Media lain yang mengandung beberapa bahan dengan komposisi yang tidak tetap disebut media non-sintetik. Contoh dari media non-sintetik misalnya Nutrient Broth yang mengandung ekstrak daging sapi dan peptone dimana komposisi kimianya tidak tetap.

      Pembuatan media dapat dilakukan dengan cara menimbang masing-masing komponen bahan kimia secara teliti, kemudian mencampurkanya, melarutkannya di dalam aquadest, mengatur pHnya, masukan kedalam tabung dan mensterilkannya menggunakan autoklaf pada suhu dan waktu yang ditetapkan, misalnya suhu 121°C (tekanan 151b) selama 15-20 menit. Bermacam-macam media yang diperdagangkan yaitu dalam bentuk campuran lengkap kering, sehingga dalam penggunaanya hanya tinggal melarutkannya menggunakan aquadest dan mensterilisasi.

      Media padat mengandung bahan pemadat seperti agar, silika gel, atau gelatin. Yang paling sering digunakan adalah jenis agar yang terbuat dari ganggang laut dan telah diperdagangkan dalam bentuk murni dan kering. Agar biasanya dicampur dalam media sebelum sterilisasi. Selama pemanasan agar akan mencair pada suhu 97-100°C Dan setelah disterilisasi agar akan mulai memadat pada suhu 42°C. Media agar yang akan digunakan untuk inokulasi mikroba harus didiamkan terlebih dahulu supaya tidak terlalu panas (sekitar 45° C), apabila saat inokulasi media agar masih panas maka sebagian  mikroba yang diinginkan tumbuh kemungkinan mati.

c.       Bentuk dan jumlah media

      Jumlah media yang akan digunakan harus diperhitungkan sedemikian rupa untuk menghindari pembuatan meda yang berlebihan. Kebutuhan media dapat ditentukan berdasarkan bentuk media yang digunakan dan jumlah pekerjaan, contoh sebagai berikut :

            Tabel 1. Takaran media

Bentuk media	Jumlah media
Agar cawan	15-20 ml/ cawan petri (Ø 10 cm)
Agar tegak	±8-9 ml/tabung teaksi (Ø 16 mm)
Agar miring	±6-7 ml/ tabung reaksi (Ø 16 mm)
Media cair	±9-10 ml/ tabung reaksi (Ø 16 mm)
Media cair berisi tabung durham	±10 ml/ tabung reaksi (Ø 16 mm)

d.      Larutan pengencer

      Seperti halnya media, larutan pengencer digunakan untuk mengencerkan contoh biasanya mengandung buffer untuk menjaga keseimbangan ion dari mikroba. Buffer yang biasa digunakan dalam pembuatan medium  dan larutan pengencer adalah fosfat, karena merupakan salah satu komponen organik yang mempunyai sifat buffer pada kisaran pH sekitar normal, yaitu kisaran pH yang dapat mempertahankan fisiologi dari mikroba. Selain itu fosfat tidak bersifat racun terhadap mikroba, merupakan sumber  fosfor untuk pertumbuhan mikroba. Garam fosfat yang sering digunakan sebagai buffer adalah kalium monohidrogen fosfat (K­­­₂H_­PO₄) dan atau kalium dihidrogen fosfat (K­­­H_­2PO₄). Sebagai larutan pengencer, selain larutan yang mengandung buffer fosfat, dapat juga digunakan larutan garam fisiologi (0,85% NaCl dalam air aquadest).

      Larutan pengencer dapat ditempatkan di dalam tabung-tabung reaksi dalam jumlah 9 ml untuk membuat pengenceran 1:10 (1ml atau 1g contoh didalam 9ml), di dalam botol pengencer dengan jumlah 90 ml untuk pembuatan pengenceran 1:10 (10 ml atau 10 g contoh di dalam 90  ml). Larutan pengencer dapat juga diletakan di dalam tabung-tabung erlenmeyer dalam jumlah 225 ml atau di dalam 450 ml yaitu untuk contoh yang kurang seragam sehingga dibutuhkan contoh dalam jumlah besar. Sterilisasi di didalam tabung atau botol dilakukan seperti pada sterilisasi media.

e.      Persiapan sampel

      Dalam analisa mikrobiologi dalam persiapan sempel harus dilakukan dengan steril didekat nyala bunsen, selain perlakuan yang steril, peralatan yang digunakan juga harus dalam kondisi steril juga agar sampel tidak terkontaminasi peralatan yang kotor. selain itu analis harus memakai perlengkapan praktikum bersih dan lengkap, seperti jas lab, hairnet, masker,sarung tangan yang telah disemprot alkohol. Hal ini dimaksudkan agar mikroba yang dianalisa murni dari sampel.

      Sampel yang akan dianalisa umumnya ada 3 macam jenis yaitu:  sampel dalam keadaan beku, makanan padat dan semi padat, minuman atau makanan cair. Tiga sampel tersebut memiliki perlakuan yang berbeda-beda, yaitu seperti berikut :

ü   Thawing produk beku :

1.      Lakukan thawing pada saat akan dilakukan analisa

2.      Lakukan thawing pada kemasan aslinya atau kemasan yang digunakan ketika contoh tiba dilaboratorium

3.      Lakukan thawing pada suhu 2-5ºC dalam waktu 18 jam atau pada suhu 45 ºC, aduk contoh secara kontinyu.

ü   Makanan padat dan semi padat

1.      Aduk contoh secara merata dengan menggunakan sendok atau alat lain sebelum pengambilan contoh uji

2.      Timbang 50 g contoh secara aseptis dan masukan kedalam erlenmeyer yang telah berisi 450 ml larutan stok Bterfiled’s Posphate Buffered sehingga diperoleh pengenceran 1: 10.

3.      Homogenkan dengan stomacher selama 2 menit. Ini merupakan larutan dengan pengenceran 10^-1.

4.      Kemudian ambil 1 ml larutan dari pengenceran 10^-1 masukan dalam larutan pengencer Bterfiled’s Posphate Buffered 9 ml ini merupakan pengenceran 10^-2, buat seri pengenceran 10^-3,dan seterusnya dengan cara yang sama.

ü   Minuman atau makanan cair

1.      Aduk contoh secara merata dengan menggunakan sendok atau alat lain sebelum pengambilan contoh uji.

2.      Contoh yang akan diuji dimulai dengan pengenceran 10⁰ (contoh tanpa pengenceran).

3.      Lakukan pengenceran 10^-1 dengan mengambil 25 ml contoh dan diencerkan dengan 225ml larutan pengencer Bterfiled’s Posphate Buffered.

4.      Kemudian dibuat seri pengenceran 10^-2, 10^-3,dan seterusnya sengan menggunakan larutan Bterfiled’s Posphate Buffered.

E.     Pengujian Angka Lempeng Total

                  Metode yang dapat digunakan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam bahan pangan terdiri dari metode hitung cawan, “Most Probable Number” (MPN) dan hitung mikroskopik langsung. Dari ketiga metode tersebut, metode hitung cawan adalah metode yang banyak digunakan. Metode lain yang dapat digunakan untuk menghitung jumlah mikroba dalam suatu larutan adalah metode turbidimetri (kekeruhan) menggunakan spektrofotometer. Metode ini sukar diterapkan pada bahan pangan karena karena medium yang diukur harus bening, sedangkan ekstrak bahan pangan biasanya mengandung komponen-komponen yang dapat menyebabkan medium menjadi keruh, sehingga kekeruhan tidak sebanding dengan jumlah mikroba di dalamnya.

      Prinsip metode hitung  cawan adalah sebagai berikut: jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikroba tersebut akan berkembang biak membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode hitung cawan  merupakan cara yang paling sensitif untuk menghitung jumlah mikroba dengan alasan sebagai berikut :

a.       Hanya sel yang masih hidup yang dihitung

b.      Beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekalian

c.       Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba karena koloni yang terbantuk berasal dari satu sel mikroba dengan penampakan pertumbuhan yang spesifik.

      Selain keuntungan setiap metode juga mempunyai kelemahan, begitu juga dengan metode hitung cawan ini mempunyai kelemahan-kelemahan sebagai berikut :

a.       Hasil perhitungan tidak menunjukan jumlah sel mikroba yang sebenarnya, karena beberapa sel berdekatan memungkinkan  membentuk satu koloni.

b.      Medium dan kondisi yang berbeda mungkin menghasilkan nilai yang berbeda.

c.       Mikroba yang ditumbukan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang kompak dan jelas, tidak menyebar.

d.      Memerlukan waktu inkubasi beberapa hari sehingga pertumbuhan koloni dapat dihitung.

1.      Peralatan

 a.     Inkubator suhu 35°C ±1°C

 b.    Timbangan

 c.     Stomacher

 d.    Pipet ukuran 1ml

 e.     Pipet ukuran 10ml

 f.      Labu ukur  100 ml

 g.     Labu ukur  1000ml

 h.     Gelas ukur 500 ml

 i.       Laminar flow (lemari steril)

 j.      Cawan petri

 k.    Erlenmeyer

 l.       Botol sampel bertutup berulir

 m.   Wadah pipet

 n.     Vorteks

 o.    Kantong plastik steril

 p.    Bunsen

 q.    Autoklaf

 r.      Hot plate stirer

 s.     Magnetic stirer

 t.      pH meter

 u.     Refrigerator

2.      Media dan Pengencer

 a.     Media dan pengencer

                                       i.      Plate Count Agar (PCA)

                                     ii.      Butterfiled’s Phosphate Buffered

3.      Pembuatan Media

1.      Media Plate Count Agar (PCA)

      Timbang media PCA bubuk sebanyak sebanyak 23,5 g (DIFCO), larutkan dalam aquadest 1L, panaskan di atas hote plate stirer  dan aduk menggunakan magnetic stirer sampai larut. Sterilisasi dengan autoklaf selama 15menit pada suhu 121°C. Media PCA dapat dibuat pada volume yang lebih kecil dengan jumlah PCA yang sesuai dengan perbandingan.

2.      Larutan stok Butterfiled’s Phospate Buffered

      Larutkan 34 g KH­­₂PO₄ dalam 500 ml aquadest. Atur pH dengan NaOH 1N sehingga mencapai pH 7,2. Tepatkan volume 1000 ml dengan aquadest. Sterilisasi pada suhu 121°C selama 15 menit. Simpan dalam refrigerator (larutan Butterfiled’s Phosphate Buffered stok)

3.      Larutan pengencer Butterfiled’s Phosphate Buffered

      Untuk membuat larutan pengencer Butterfiled’s Phosphate Buffered, ambil 1,25 ml larutan Butterfiled’s Phosphate Buffered stok. Tambahkan dengan aquadest sampai volume 1000 ml, kemudian masukan dalam botol pengencer 450, 225, 90 ml atau  9 ml sesuai kebutuhan. Sterilisasi pada  suhu 121°C selama 15 menit.

4.      Pesiapan Contoh

1.      Makanan padat dan semi padat      

a.       Timbang 50 g contoh secara aseptis kedalam kantong plastik steril dan masukkan 450 ml larutan pengencer Butterfiled’s Phosphate Buffered sehingga diperoleh pengenceran 1:10

b.      Homogenkan dengan stomacher selama 2 menit. Ini merupakan larutan pengencer dengan pengenceran 10_­­^-1_.

2.      Minuman

a.       Aduk sampai merata dengan menggunakan sendok atau alat lain sebelum pengambilan contoh uji

b.      Ambil 10 ml contoh dan diencerkan dengan 90 ml larutan pengencer Butterfiled’s Phosphate Buffered sehingga diperoleh pengenceran 1:10. ini merupakan larutan  dengan pengenceran 10^-1_.

5.      Analisa Angka Lempeng Total

1.      Dari persiapan contoh, dibuat pengenceran selanjutnya (10^-2,10^-3,10^-4, dan seterusnya sesuai kebutuhan)  dengan mengambil 1 ml larutan sebelumnya menggunakan pipet steril kedalam 9 ml larutan pengencer.

2.      Kocok  setiap pengenceran dengan menggunakan vorteks.

3.      Pipet 1 ml tingkat pengenceran yang di inginkan kedalam cawan petri steril, lakukan duplo.

4.      Tuangkan 12-15 ml agar PCA ke dalam cawan petri yang telah diberi contoh.

5.      Campurkan contoh dan agar dengan mengerakan cawan petri  sedemikian rupa sehingga campuran tersebar merata.

6.      Biarkan agar memadat.

7.      Inkubasikan pada suhu 35ºC ± 1ºC selama 48 ± 2 jam dengan posisi cawan terbalik.

6.      Perhitungan dan Pelaporan Jumlah Mikroba

Hitung jumlah mikroba dengan cara berikut :

            Cawan petri dengan koloni normal (yang tidak ditumbuhi oleh koloni berbentuk spreader). Hitung semua koloni yang ada dalam semua cawan petri tersebut termasuk yang berukuran kecil, catat dengan pengenceran masing-masing. Jumlah koloni yang akan diolah datanya antara 25-250 koloni.

            Cawan petri dengan jumlah koloni lebih dari 250 koloni. Pada cawan petri yang ditumbuhi lebih dari 250 koloni nyatakan dalam terlalu banyak untuk dihitung (TBUD), kecuali untuk cawan yang jumlahnya hampir mendekati 250 koloni. Koloni Spreader Ada 3 macam koloni, yaitu:

a.    Merupakan rantai yang tidak terpissah

b.    Spreader yang terbentuk pada bagian tengah agar sampai dasar cawan petri

c.    Spreader yang terbentuk pada pinggir atau permukaan agar

            Untuk koloni spreader seperti rantai: apabila terjadi hanya satu rantai, maka koloni dianggap 1, tetapi apabila ada lebih dari satu rantai terpisah, maka setiap sumber rantai dihitung sebagai koloni terpisah.  Kombinasikan hitungan spreader dengan angka lempeng total.

Ø   Cawan petri tanpa koloni

            Jika tidak ada koloni yang terbentuk pada semua cawan petri jumlah koloni sebagai <1 dikalikan dengan pengenceran yang terkecil.

1.    Cara perhitungan:

a.       Cawan petri dengan koloni normal (25-250):

      Hitung jumlah koloni dengan rumus berikut:

Dimana :

N      =  jumlah koloni per ml atau per gram

∑C    = jumlah koloni  dari tiap-tiap petri

n₁        = jumlah petri dari pengenceran pertama koloni yang dihitung

n₁        = jumlah petri pengenceran kedua koloni yang dihitung

d       = pengenceran pertama yang dihitung

                            Tabel 2 Contoh perhitungan TPC

10-2	10-3
232 244	33 28

N   = (232+244+33+28)

         [(1x2) +(0,1x2)]x 10^-2

      = 537/0,022

      = 24.049

      = 24.000 (2,4 x 10⁴)

         Jika dalam suatu pengenceran, salah satu dari cawan petri tercatat koloni kurang dari 25-250 atau lebih dari 250, maka yang dihitung hanya koloni yang terletak antara 25-250 koloni.

b.      Semua cawan petri lebih kecil dari 25 koloni

         Catat jumlah koloni yang terbentuk dan nyatakan hasil sebagai  jumlah bakteri lebih kecil dari 25 dikalikan pengenceran yang terendah.

Tabel 3. Contoh perhitungan TPC

Jumlah koloni
10‑2	10-3	Perkiraan jumlah bakteri
18 0	2 0	< 25 x 102 = <2,5 x 103

c.         Semua cawan petri lebih besar dari 250 koloni

            Jika jumlah koloni dari masing-masing cawan petri lebih dari 250 koloni, perkiraan jumlah bakteri dengan mengalikan jumlah koloni pada pengenceran tertinggi dengan pengencernya.

Tabel 4. Contoh perhitungan TPC

Jumlah koloni
10-2	10-3	Perkiraan jumlah bakteri
TBUD	640	>250 X 103 =>2,5 X 105 (6,4 x 105)
TBUD	640

d.        Semua cawan ditumbuhi koloni spreader, dinyatakan sebagai spreader (SPR)

e.         Semua cawan petri tidak ditumbuhi koloni

         Jika pada semua cawan petri tidak ditemukan koloni yang tumbuh, maka nyatakan hasilnya sebagai lebih kecil dari 1 kali pengenceran terkecil.

Tabel 5. Contoh perhitungan TPC

Jumlah koloni
10-1	10-2	Perkiraan jumlah bakteri
0	0	<1,0x10-1
0	0

2.    Cara Pembulatan :

            Dalam melaporkan jumlah koloni atau jumlah koloni perkiraan hanya 2 angka penting yang digunakan, yaitu angka pertama dan kedua, dengan menggunakan aturan pembulatan sebagai berikut :

1.      Bila angka ketiga lebih besar dari 5, bulatkan keatas.

2.      Bila angka ketiga klebih kecil dari 5, bulatkan kebawah.

3.      Bila angka ketiga 5, lakukan pembulatan sebagai berikut :

a.       Bulatkan keatas apabila angka kedua merupakan angka ganjil

b.      Bulatkan ke bawah bila angka kedua merupakan angka genap

Tabel 6. Pembuatan data TPC

Hasil Perhitungan	Pembulatan	Pelaporan
12.700	13.000	1,3 x 104
12.400	12.000	1,2 x 104
15.500	15.000	1,5 x 104
14.500	14.000	1,4 x 104

Pencatatan dalam Logbook Hasil Pengujian

Catat dalam logbook hasil pengujian :

1.      Jenis, jumlah dan kondisi contoh

2.      Kode contoh

3.      Tanggal distribusi contoh

4.      Jenis, metode dan metode rujukan analisis

5.      Target penyelesaian

6.      Nama Analis

7.      Jumlah sampel yang digunakan dalam analisis

8.      Tingkat pengenceran yang digunakan

9.      Jumlah koloni pada setiap cawan duplo baik yang dari 25, maupun yang lebih dari 250

10.  Hasil perhitungan

11.  Jumlah mikroba per ml atau per gram sebagai pembulatan dari hasil perhitungan dengan penulisan satu digit desimal di depan koma.

F.      Pewarnaan Mikroba

      Pendahuluan

      Untuk mengamati bentuk atau ciri-ciri suatu mikroba menggunakan mikroskop, dapat digunakan beberapa cara :

1. Dengan mengamati sel-sel mikroba yang masih hidup tanpa diwarnai, yaitu dengan menggunakan preparat basah.
2. Dengan cara mengamati sel-sel mikroba yang telah mati dan diwarnai.

      Kebanyakan sel bakteri tidak bewarna, sehingga jika dilarutkan didalam air dan dilihat menggunakan mikroskop tidak memperlihatkan warna yang kontras dengan medium sekelilingnya. Warna sel mikroba dapat dibuat lebih kontras dan mudah dilihat menggunakan  mikroskop yaitu dengan mewarnai sel mikroba tersebut dengan menggunakan zat warna khusus. Zat warna yang digunakan untuk mewarnai sel mikroba tersebut dapat juga digunakan untuk  mengamati struktur bagian dari sel. Keuntungan menggunakan  pewarnaan untuk bakeri adalah bakteri yang ukuranya relatif kecil dengan pewarnaan akan lebih mudah dilihat dengan menggunakan mikroskop lensa objektif dan minyak imersi yang mempunyai tingkat pembiasan lebih tinggi.

      Dalam pewarnaan mikroba, dapat digunakan satu jenis zat warna. Cara ini disebut pewarnaan sederhana. Zat-zat warna yang biasanya digunakan untuk pewarnaan sederhana misalnya biru metilen, fucsin basa atau kristal violet. Zat-zat warna tersebut bekerja dengan baik dalam mewarnai bakteri karena zat-zat tersebut membentuk warna (khromofor) dan bermuatan pusitif. Oleh karena sel-sel bakteri bermuatan negatif, maka sel-sel tersebut akan mengikat khromofor. Sedanakan zat-zat warna yang mengandung khromofor yang bermuatan negatif (anion) disebut zat warna asam dan tidak dapat digunakan untuk pewarnaan sederhana karena tidak dapat diikat oleh sel bakteri.

      Bermacam-macam cara pewarnaan yang dilakukan untuk mewarnai bakteri merupakan modikifasi stau gabungan dari cara pewarnaan sederhana. Pewarnaan bakteri dapat dibedakan atas beberapa golongan yaitu :

·        Pewarnaan Sederhana

·        Pewarnaan Diferensial

·        Pewarnaan Asam capat (acid- fast)

·        Pewarnaan Struktural

·        Pewarnaan Inti sel (flugen)

·        Pewarnaan Endospora

·        Pewarnaan Dinding sel

·        Pewarnaan Kapsul

·        Pewarnaan Flagela

·        Pewarnaan untuk menguji adanya komponrn-komponen tertentu didalam sel separti : glikogen dan lipida

      Di dalam laporan ini akan dibahas dua cara pewarnaan yang paling mudah dan paling sering dilakukan dalam mikrobiologi pangan yaitu pewarnaan gram dan pewarnaan endospora.

1.      Pewarnaan Gram

      Pewarnaan gram merupakan salah satu cara pewarnaan yang paling sering dilakukan dalam pekerjaan mikrobiologi. Cara pewarnaan ini diciptakan pertama kali tahun 1884 oleh seorang bakteriologi yang bernama Chrisian Gram untuk membedakan pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Cara pewarnaan gram ini merupakan cara pewarnaan diferensial, dimana dengan dengan cara ini bakteri dapat dibedakan menjadi dua grup yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan dari keduanya disebabkan oleh perbedaan dalam lapisan-lapisan dinding selnya.

      Dalam pewarnaan gram diperlukan empat jenis larutan yaitu larutan zat warna basa, mordant, pencuci zat warna dan satu zat warna lainnya (counterstain) yang berbeda dengan zat warna yang pertama. Mordant adalah salah satu zat yang dapat menaikkan afinitas atau pengikat antara sel dengan zat warna. Beberapa contoh mordant misalnya asam, basa, gram metal, dan yodium. Dengan adanya mordant, zat warna akan lebih sukar tercuci. Pencuci warna digunakan untuk menghilangkan zat warna dari sel-sel lainya. Dalam pewarnaan gram dan pewarnaan diferensial lainya, perbedaan dari bakteri disebabkan oleh perbedaan dalam kecepatan merlepaskan zat warna oleh sel. Zat warna kedua yang digunakan setelah sel dicuci dengan larutan pencuci  disebut “counterstain” yang berbeda warna dari zat warna pertama, sedangkan sel-sel yang dapat segera melepaskan zat setelah pencucian akan mengikat  zat warna kedua.

      Dalam pewarnaan gram, mula-mula sel bakteri diwarnai dengan zat warna basa yaitu kristal violet, diikuti dengan perlakuan menggunakan suatu mordant yaitu larutan yodium (lugol). Sel kemudian dicuci derngan menggunakan alkohol untuuk menghilangkan kristal violet. Pencucian dengan alkohol yang berlebihan dapat menghilangkan warna yang telah diserap oleh dinding sel. Setelah dicuci dengan air, kemudian diwarnai dengan “counterstain” yaitu safranin. Selain safranin, fuchsin basa juga dapat digunakan sebagai counterstain. Sel-sel yang tidak dapat melepaskan warna dan akan berwarna tetap seperti warna kristal violet yaitu biru ungu disebut bakteri gram positif sedangkan sel-sel yang dapat melepaskan kristal violet dan mengikat safranin serhingga bewarna merah muda disebut bakteri gram negatif.

 

Gambar 3. Mekanisme kerja zat pewarna

2.      Pewarnaan Endospora

      Spesies bakteri yang termasuk dalam generasi clostridium dan bacallus memproduksi suatu struktur di dalam selnya yang disebut endospora. Jika sel semakin tua, maka akan lebih tahan lama dalam keadaan lingkungan yang ekstrim misalnya dalam keadaan yang kering, panas atau lebih tahan terhadap pewarnaan dan sekali berhasil diwarnai, spora sangat sukar melepaskan zat warna, sehingga tidak mengikat zat warna lainya yang diberikan kemudian (caunterstain). Prinsip pewarnaan ini digunakan untuk membedakan spora dari sel vegetatif. Zat warna yang paling sering digunakan untuk mewarnai spora adalah malachite green (schaeffer dan fulton) yang tetap diikat oleh spora setelah pencucian dengan air dan sebagai conterstain digunakan safranin. Dengan cara ini endospora yang masih terdapat di dalam spora vegetatif dan spora bebas akan berwarna hijau-biru, sedangkan sel vegetatif akan berwarna merah  sampai merah muda.

3.      Cara kerja

a.       Persiapan dan fiksasi

            Fiksasi adalah membunuh bakteri dan membuat sel-sel bakteri tersebut melekat pada gelas objek.

ü      Makanan kultur/cair. Disebarkan satu loop makanan atau kultur cair pada gelas objek sehingga mencapai diameter kira-kira 1-1,5 cm^{2 ­}_­­­­. Dikeringkan di udara dan difiksasi dengan nyala api kecil.

ü      Makanan / kultur padat.  Diberi setetes air pada gelas objek dan diambil sejumlah kecil pertumbuhan mikroba menggunakan ujung loop, kemudian disebarkan pada setetes air di atas gelas objek sehingga mencapai diameter kira-kira 1-1,5 cm² . Suspensi yang terbentuk tidak boleh terlalu tebal. Kemudian dikeringkan di udara dan di fiksasi dengan nyala api kecil.

 

 

Gambar  2. Diagram persiapan kultur bakteri untuk pewarnaan

b.      Pewarnaan gram

1.            Diteteskan pewarna kristal violet diatas filem pada gelas objek dan biarkan selama  1 menit.

2.            Bilas dengan aquadest dengan cara memegang gelas objek  pada posisi miring.

3.            Sisa air yang tertinggal di buang dan di keringkan setelah itu tetesi dengan yodium gram (lugol) selama 1 menit.

4.            Setelah itu dicuci dengan aquadest, kemudian dihilangkan warnanya menggunakan alkohol 95% selama 10-20 detik atau sampai warna biru tidak luntur lagi.

5.            Dicuci lagi sebentar, kemudian ditetesi dengan pewarna conterstain yaitu larutan safranin selama 10-20 detik.

6.            Dibilas dengan air dan dikeringkan dengan tissu.

7.            Diamati dengan menggunakan mikroskop dengan lensa objektif minyak imersi, cara pengelompokan (tunggal, berpasangan, rantai, bergerombol) pembentukan spora dan reaksi gram.   

c.       pewarnaan endospora bakteri

            Mula-mula dibuat filem tipis seperti pada pewarnaan gram, dikeringkan di udara dan difiksasi dengan nyala api kecil. Teteskan pewarna malasit hijau (malachite green) diteteskan diatas nyala filem dan biarkan selama 20 menit tanpa pemanasan atau selama 5 menit diatas penangas air. Setiap kali pewarna menjadi kering  tetesi lagi pewarna yang baru. Kemudian cuci secara hati-hati dengan menggunakan aquadest 20-30 detik sampai warna hijau tidak luntur. Filem ditetesi dengan safranin (untuk mewarnai sel) selama 30 detik, bilas dengan aquadest dan bersihkan dengan tissu.

            Objek diperiksa dengan menggunakan mikroskop menggunakan lensa objektif minyak imersi. Endospora bakteri akan bewarna hijau-hijau muda, sedangkan sel vegetatif bawarna merah-merah muda. Diamati besar dan bentuk spora, letak spora didalam sel, pengembangan sel vagetatif atau spora mungkin telah dikeluarkan dari sel jika kultur yang diamati sudah terlalu tua.

G.    Pembuatan Kultur Kapang pada Glas Obyek (Slides Cultur)

      Identifikasi isolat kapang dilakukan melalui dua tahap. Tahap pertama yaitu, pengamatan  kapang secara mikroskopis yang meliputi pengamatan terhadap warna dan bentuk koloni. Tahap kedua yaitu, pengamatan mikroskopis yang dilakukan dengan membuat Slides Cultur yang meliputi pengamatan dalam bentuk hifa (bentuk dan ukuran konida). Pembuatan Slides Cultur dapat di lakukan dengan cara sebuah cawan petri diberi alas kertas saring sehingga alas bagian bawah cawan tertutup. Suatu batang glas berbentuk U atau V diletakan didalamnya dan diatasnya diletakan glass obyek berdampingan dengan glas penutup. Cawan tersebut disterilisasi kering menggunakan oven. Setelah dingin diatas gelas obyek ditetesi medium cair steril yaitu Potato Dextrose Agar / Malt Exstract Agar atau Glucose Agar. Diratakan dengan loop atau batang gelas steril sehingga membentuk lapisan tipis dengan luas tidak melebihi gelas penutup dan biarkan membeku didalam cawan tertutup. Setelah membeku, permukaan agar diinokulasi dengan sedikit spora kapang dengan menggunakan ose, kemudian tutup dengan gelas penutup steril. Sebanyak 5-7 ml gliserol 10% steril diteteskan di atas kertas filter untuk memberikan kelembaban yang optimum selama pertumbuhan kapang, inkubasi dilakukan pada suhu kamar selama 3-5 hari, kemudian struktur kapang diamati menggunakan mikroskop, mula-mula dengan pembesaran rendah (100 kali) kemudian dengan pembesaran tinggi (400 kali, high dry).

Gambar 3. Tahap pembuatan slides kultur: (A) Agar diletakan dalam gelas obyek yang diambil dari media PDA steril. (B) Cawan petri yang berisi batang penahan yang berbentuk U. (C) Inokulasi kapang pada media PDA yang telah disimpan diatas gelas obyek. (D) Agar yang telah di inokulasi tutup dengan kaca penutup gelas obyek.

H.    Pemeliharaan Kultur

      Pengawetan kultur merupakan suatu cara untuk mempertahankan kultur mikroba atau kultur murni dari suatu mikroba dalam waktu tertentu. Lama mikroba bertahan tergantung oleh jenis media dan teknik pengawetan yang digunakan. Pengawetan mikroba dibagi menjadi dua yaitu pengawetan jangka panjang dan pengawetan jangka pendek.

1.      pengawetan jangka pendek

      Pengawetan jangka pendek biasanya menggunakan media agar yaitu agar miring, agar cawan, agar tusuk atau dalam media semi padat (tabung reaksi), pengawetan ini dilakukan dengan pendinginan. Berdasarkan  media yang digunakan pengawetan jangka pendek, mikroba bertahan sekitar 3 minggu dan setiap 3 minggu sekali harus disegarkan kembali dengan mengambil satu sel atau lebih mikroba hidup dan diinokulasi kemedia baru secara aseptis dan diinkubasi sesuai dengan pertumbuhan mikroba dan selanjutnya disimpan dalam refrigerator. Jika disimpan dalam suhu kamar, media harus ditambah dengan mineral oil untuk menjaga kelembabanya.

2.      pengawetan jangka panjang (manik-manik)

      Manik-manik yang digunakan untuk pengawetan kultur biasanya menggunakan manik-manik khusus bisa juga menggunakan manik-manik biasa. Adapun caranya adalah sebagai berikut :

a.       Manik-manik dimasukan dalam kuvet sebanyak 75% dari besarnya kuvet kemudian disterilisasi pada suhu 121°C selama 15 menit. Bisa juga digunakan tabung reaksi steril.

b.      Manik-manik yang sudah steril ditambahkan suspensi kultur murni sampai manik-manik terendam, dilakukan secara aseptis.

c.       Didiamkan selama 2-3 jam.

d.      Diambil cairan dari kuvet (suspensi kultur) dengan menggunakan pipet dan kemudian digantikan dengan gliserol 20% sampai terrendam kemudian ditutup. Dilakukan secara aseptis.

e.       Disimpan dalam refrigerator (suhu 7°C)

Pengamatan

      Amati viabilitas dari kultur yang telah imobilisasikan tersebut secara kualitatif yaitu dengan menumbuhkan kembali 1 atau 2 butir kultur yang telah diimobilisasikan tersebut kedalam media cair (PDB atau MRSB) inkubasikan selama 2 hari (bakteri dan khamir) serta 6 hari (kapang). Amati ada tidaknya pertumbuhan bakteri dengan ciri-ciri adanya kekeruhan, endapan, filamen kapang atau yang lainya.

I.       Analisa Kapang Khamir

      Kapang merupakan anggota regnum fungi (kerajaan jamur) yang biasanya tumbuh pada permukan makanan yang sudah basi atau terlalu lama tidak diolah. Sebagian besar kapang merupakan anggota dari kelas Ascomycetes. Khamir adalah fungi akasel (uniseluler) yang beberapa jenis spesiesnya umum digunakan untuk membuat roti, fermentasi minuman beralkohol dan bahkan digunakan pada sel bahan bakar. Kebanyakn khamir merupakan anggota devisi Ascomycota, walaupun ada juga yang digolongkan dalam Basidiomycota. Beberapa jenis khamir, seperti Candida albicans, dapat menyebabkan infeksi pada manusia (kandidiasis). Lebih dari seribu spesies khamir telah diidentifikasi. Khamir yang paling umum digunakan adalah, yang dimangfaatkan untuk produksi anggur, roti tape dan bir sejak ribuan tahun yang silam dalam bentuk ragi.

Cara Kerja

a.      Metode rujukan

1)      Bakteriologikal Analytical Manual Online

2)      Metode pengujian cemaran mikroba dalam SNI Tepung Terigu 2006

b.Peralatan

1)      Meja kerja

2)      Cawan petri

3)      Pipet ukur 1,5 dan 10 ml

4)      Tabung pengencer

5)      Botol media

6)      Wadah pipet dan cawan petri

7)      Inkubator suhu 25±1ºC

8)      Kantong plastik steril

9)      Stomacher

10)  Pembakar bunsen

11)  Timbangan analitik

12)  Magnetik stirer

13)  Pengocok tabung (vortex)

14)  Autoklaf

15)  Lemari steril (laminar flow)

16)  Refrigerator

17)  Freezer

c.       Persiapan Contoh

1)      Makanan padat dan semi padat

a)Contoh diaduk secara merata dengan menggunakan spatula atau alat lain sebelum pengambilan contoh uji.

b)      Ditimbang 25 gram contoh secara aseptis dan dimasukan kedalam erlenmeyer yang telah berisi 225 ml larutan Butterfiled’s phosphate Buffered sehingga diperoleh pengenceran 1 : 10.

c)Homogenkan dengan Stomacher selama 2 menit. Ini merupakan larutan dengan pengenceran 10^-1, kemudian dibuat pengenceran 10^-2 ,10^-3 , dan seterusnya.

2)      Minuman atau makanan cair

a)         Contoh diaduk secara merata dengan menggunakan spatula atau alat lain sebelum pengambilan contoh uji.

b)        Contoh yang diuji dimulai dari pengenceran 10⁰ (contoh tanpa pengenceran)

c)         Dilakukan pengenceran 10^-1 dengan mengambil 25 ml contoh dan diencerkan dengan 225 ml larutan Butterfiled’s phosphat Buffered

d)        Kemudian dibuat seri pengenceran 10^-2, 10^-3 dst dengan menggunakan larutan Butterfiled’s phosphate Buffered.

d.      Analisa total kapang khamir

1)      Dari persiapan contoh, dipipet 1ml dsari masing-masing pengenceran sesuai kebutuhan ke dalam cawan petri stril secara duplo.

2)      Dituangkan media PDA yang telah ditambah asam tartarat atau antibiotik kedalam cawan. Dan digoyangkan cawan petri sampai larutan tercampur merata. Dan biarkan sampai membeku.

3)      Diinkubasikan pada suhu 30 ± 1°C selama 5 hari (posisi cawan terbalik).

4)      Hitung koloni dan laporkan sebagai jumlah kapang khamir.

e.      Perhitungan

      Hitung semua koloni yang ada dalam cawan petri. Pilih cawan yang menunjukan jumlah koloni 10-150 per cawan. Hitung rata-rata jumlah koloni dan dikalikan dengan faktor pengenceran. Perhitungan jumlah kapang khamir sama dengan perhitungan TPC.

J.      Analisa Sallmonela

      Salmonella merupakan suatu genus bakteri entrobakteria gram-negatif berbentuk tongkat yang menyebabkan tifus, paratifus, dan penyakit foodbrone. Spesies Salmonella dapat bergerak bebas menghasilkan hidrogen sulfida. Salmonella dinamai dari nama Daniel Edward salmon, ahli patologi Amerika, walaupun sebenarnya, rekanya Theobald Smith (yang terkenal akan hasil pada anafilaksis) yang pertama kali menemukan bakterium tahun 1885 pada tubuh babi.

      Jenis Salmonella yang menyebabkan penyakit adalah Salmonelosis, biasanya Salmonella triphimorin dan Salmonella enteridish. Sumber infeksi yang diserang bakteri ini adalah jenis makanan hewani seperti sosis ikan, telur karena makanan tersebut terkontaminasi oleh Salmonella yang berasal dari kecoa, lalat, dan tikus. Salmonella enteridish menyebabkan diare berdarah. Biasanya penyakit ini timbul 12-24 jam setelah memakan makanan yang terkontaminasi oleh Salmonella.

Cara kerja

a.      Metode Rujukan

Bacteriological Analitical Manuals online Revisi Desember 2007. Chapter 5. Salmonella. Food and Drug Administratio.

b.      Peralatan

1)      Cawan petri

2)      Tabung reaksi

3)      Pipet 10 ml

4)      Botol media

5)      Gunting

6)      Pinset

7)      Jarum ose

8)      Stomacher

9)      Pembakar bunsen

10)  Timbangan

11)  Magnetik stirer

12)  Pengocok tabung (vortex)

13)  Inkubator 35 ± 1ºC

14)  Inkubator 42 ± 0,2ºC

15)  Penangas air

16)  Autoklaf

17)  Lemari steril (laminar flow)

18)  Lemari pendingin (refrigerator)

c.  Media dan pengenceran

1)      Media dan larutan pengencer

a)      Lactose Broth (LB)

b)      Tetrathionate Broth (TTB)

c)      Rappapport Vassiliadis (RV)

d)      Xylose Lysine Desoxychiolate (XLDA)

e)      Hektone Enteric Agar (HEA)

f)        Bismuth Sulfite Agar (BSA)

g)      Triple Sugar Iron Agar (TSIA)

h)      Lysine Iron Agar (LIA)

i)        Lysine Decarboxylase Broth (LDB)

j)        Kalium Candida Broth (KCNB)

k)      Methyl Red-voges proskauer (MR-VP)

l)        Simmon Citrate Agar (SCA)

m)    Tryptose Broth (TB)

n)      Trypticase Soy Tryptone Broth (TSTB)

o)      Sulfite indol motility (SIM)

p)      Brain Heart infusion (BHI)

q)      Urea Broth (UB)

r)       Malonate Broth

s)       Phenole Red Lactose Broth

t)        Phenole Red Sucrose Broth

u)      Reagen Kovac

v)      Kristal Keratin

w)    Larutan Brom sceresol Purple Dye 0,2%

x)      Larutan Physiological Saline 0,85%

y)      Larutan a naphtol

z)       Larutan KOH 40%

aa)   Methyl Red Indicatore

d.      Persiapan contoh

a)      Susu (cair, bubuk, formula) dan tepung

      Secara aseptik, timbang 25 g contoh ke dalam botol sampel steril bermulut lebar bertutup ulir (500ml) atau wadah lainnya. Untuk contoh bukan bubuk tambahkan 15 ml Lactose Broth, 10,10, dan 190 ml, sehingga total volume mencapai 225 ml. Aduk dengan baik sampai tidak ada gumpalan. Tutup botol dengan baik dan biarkan selama 60 ± 5 menit pada suhu ruang. Campur dengan baik digoyangkan dan tetapkan pH yang diperlukan, tetapkan pH menjadi 6.8 ± 0,2 dengan NaOH 1N atau HCl 1N. Tutup botol dengan baik dan kocok dengan baik sebelum menentukan pH akhir. Longgarkan tutup ulir botol sampai ¼ putaran dan inkubasikan selama 24 ± 2 jam pada suhu 35°C.

b)      Saos tomat

      Timbang secara aseptis 25 g contoh kedalam kantung plastik Stomacher steril. Tambahkan 225 ml Lactose Broth steril dan campurkan selama 2 menit menggunakan Stomacher. Pindahkan secara aseptis campuran yang sudah homogen kedalam botol sempel bermulut lebar, bertutup ulur steril (500ml) atau wadah yang tepat dan biarkan selama 60 ± 5 menit pada suhu ruang dengan botol tertutup rapat. Campur dengan baik dengan menggoyangkan dan tetapkan pH 6,8 ± 0,2. Longgarkan tutup ulir botol sampai ¼ putaran dan inkubasikan selama 24 ± 2 jam pada suhu 35°C.

e.      Pengujian salmonella

1)      Pengayaan dan isolasi Salmonella

a)      Tutup rapat dan kocok contoh yang sudah diinkubasi secara berlahan. Pindahkan 0,1 ml larutan pada 10 ml RV medium dan 1 ml pada 10 ml TTB. Kocok dengan menggunakan vortex.

b)      Inkubasi media RV pada suhu 42°C ± 0,2 °C selama 24 jam ± 2 jam dan media TTB pada suhu 35°C ± 0,2 °C selama 24 jam ± 2 jam.

c)      Amati pertumbuhan pada media RV dan TTB.

2)      Isolasi dan identifikasi

a)      Diambil suspensi dengan jarum ose dari masing-masing media pengayaan yang telah diinkubasikan, dan diinokulasikan dengan cara membuat goresan pada media HEA, XLDA dan BSA. Inkubasikan pada temperatur 35ºC  selama 24 ±  2 jam. Pada BSA, apabila hasil belum terlihat jelas, dapat diinkubasikan  lagi selama 24 ± 2 jam.

b)      Diamati koloni tipikal Salmonella

ü      Pada media HEA terlihat bewarna hijau kebiruan dengan atau tanpa titik hitam (H­­­₂S).

ü      Pada media XLDA koloni Salmonella terlihat merah muda dengan atau tanpa titik mengkilat, terlihat hitam pada hampir setiap koloni.

ü      Pada media BSA koloni Salmonella terlihat keabu-abuan atau kehitaman, kadang metalik, media disekitar koloni bewarna coklat dan semakin lama akan bewarna hitam jika di inkubasi menerus.

c)      Diambil koloni yang diduga sebagai Salmonella dari ketiga media tersebut dan diinokulasikan koloni ke Triple Sugar Iron Agar (TSIA) dan Lysine Iron Agar (LIA) dengan cara menusuk kebagian tegak agar miring, selanjutnya digores pada permukaan agar miring. Diinkubasikan pada suhu 35ºC selama 24 ± 2 jam. Diamati koloni spesifik Salmonela dengan merujuk pada hasil reaksi seperti  tercantum pada Tabel 7.

d)      Diamati koloni atipikal (tidak khas) Salmonella.

ü      Pada media HEA dan XLDA beberapa kultur Salmonela  membentuk koloni bewarna kuning  dengan atau tanpa titik hitam. Jika tidak ada koloni khas yang tumbuh, maka diambil 2 atau lebih koloni yang tidak khas.

ü      Pada media BSA koloni yang tidak khas bewarna hijau dengan sedikit atau tanpa warna kehitaman. Apabila hasil belum jelas terlihat koloni khas setelah inkubasi 24 ± 2 jam, BSA diinkubasikan lagi selama  24 ± 2 jam. Jika tetep tidak terlihat koloni khas, maka ambil 2 atau lebih koloni yang tak khas.

e)      Diinokulasikan koloni atipikal dari ketiga media tersebut, diinokulasikan ke media TSIA dan LIA dengan cara menusuk ke bagian tegak agar miring dan menggoreskanya pada permukaan agar miring menggunakan ose. Diinkubasikan pada suhu 35 ºC selama 24 ± 2 jam. Diamati koloni tipikal Salmonela dengan merujuk pada hasil reaksi seperti tercantum pada tabel 7

Tabel 7. Hasil uji salmonella spp. Pada TSIA dan LIA

Media	Agar Miring (slant)	Dasar Agar (Battom)	H2S	Gas
TSIA	Alkalin / K (merah)	Asam / A (kuning)	Positif (hitam)	Negatif / Positif
LIA	Alkalin/K(ungu)	Alkalin/K(ungu)	Positif (hitam)	Negatif / Positif

3)      Uji Biokimia

Uji ini terdiri dari beberapa pengujian yaitu :

a)      Uji Urase

b)      Uji indol

c)      Uji Voges Proskauer (VP)

d)      Uji Methyl Red (MR)

e)      Uji sitrat (C)

f)        Uji Lysine Decarboxylase Broth (LDB)

g)      Uji kalium Cyandida (KCN)

4)      Uji Gula-gula

Uji ini terdiri dari beberapa pengujian yaitu :

a)      Uji Malonate Broth

b)      Uji Phenol Red Lactose Broth

c)      Uji Phenol Red Sucrose Broth

f.        Interpretasi hasil salmonella spp.

         Interpretasi hasil uji biokimia salmonella spp. Dapat dilihat pada Tabel 8.

Tabel 8. Reaksi biokimia Salmonella.

No	B. Uji substrat	C. Hasil reaksi
		D. Positif	E. Negatif	Salmonella
1	Glukosa (TSIA)	Tusukan kuning	Tusukan merah	+
2	Lysine Dekarboksilase (LIA)	Tusukan ungu	Tusukan kuning	+
3	H2S (TSIA dan LIA)	Hitam	Tidak hitam	+
4	Lysine Dekarboksilase Broth	Warna ungu	Warna kuning	+
5	Phenol Red Dulcitol Broth	Warna kuning dengan / gas	Tanpa berubah warna dan tanpa terbentuk gas	+ a)
6	KCN Broth	Ada pertumbuhan	Tidakada pertumbuhan	-
7	Malonat Broth	Warna biru	Tidak berubah warna	- b)
8	Uji indol	Permukaan warna merah	Permukaan warna kuning	-
9	Phenol Red Lactose Broth	Warna kuning dengan / tanpa gas	Tidak terbentuk gas tidak berubah warna	- b)
10	Phenol Red Sukrosa Broth	Warna kuning dengan / tanpa gas	Tidak terbentuk gas tidak berubah warna	-
11	Uji Voges- proskauer	Merah muda sampai merah	Tidak berubah warna	-
12	Uji Methyl Red	Merah menyebar	Warna kuning	+
13	Simmon sitrat	Pertumbuhan warna biru	Tidak ada perubahan	+
Keterangan  : a)         Mayoritas dari kultur S.arizonae adalah neagti b)        Mayoritas dari kultur S.arizonae adalah positif

g.      Pelaporan

Laporkan hasil analisis sebagai negatif atau positif /25 g atau per 25 ml.

K.    Analisa Staphylococcus aureus

      Staphylococcus aureus (S. Aureus) adalah bakteri gram positif yang menghasilkan pigmen kuning, bersifat aerob fakultatif, tidak menghasilkan spora dan tidak motil, umumnya tumbuh berpasangan maupun berkelompok dan termasuk dalam famili micrococcacaceae, dengan diameter sekitar 0,8- 1,0 µm. Staphylococcus aureus tumbuh dengan optimum pada suhu 35ºC dengan waktu pembelahan 0,47 jam. Staphylococcus aureus merupakan mikroflora normal manusia. Bakteri ini biasanya terdapat pada saluran pernafasan atas dan kulit. Keberadaan Staphylococcus aureus pada saluran pernafasan atas dan kulit jarang menyebabkan penyakit, individu yang sehat biasanya berperan sebagai karir (pembawa). Infeksi serius akan terjadi apabila resistensi inang melemah karena adanya perubahan hormon, adanya penyakit, luka atau perlakuan menggunakan steroid atau obat lain yang mempengaruhi imunitas sehingga terjadi pelemahan inang.

      Staphylococcus aureus menghasilkan antrotoksin yang menyebabkan keracunan pada manusia. Bakteri ini sering terdapat pada makanan yang mengandung protein tinggi seperti sosis, telur dan sebagainya. Staphylococcus aureus tahan garam dan tumbuh baik pada medium yang mengandung 7.5 % NaCl serta dapat mefrementasi manitol. Bakteri ini menghasilkan koagulase sehingga dapat dibedakan atas beberapa grup berdasarkan sifat imunitas koagulasenya yaitu koagulase tipe I sampai VII.

      Entrotoksin yang dihasilkan oleh Staphylococcus aureus bersifat tahan panas dan masih aktif setelah dipanaskan pada suhu 100 ºC selama 30 menit. Enterotoksin Staphylococcus aureus dapat dibedakan atas lima tipe yaitu A, B, C, D, dan E. Dalam kasus keracunan makanan perlu dilakukan identifikasi sampai didapatkan tipe koagulase, tipe toksin dan tipe phage.

      Infeksi Staphylococcus aureus diasosiasikan dengan beberapa kondisi patologi, diantaranya bisul, jerawat, peneumonia, meningitis, dan artritits. Sebagian besar penyakit ini menghasilkan nanah, oleh karena itu bakteri ini disebut piogenik. Staphylococcus aureus juga menghasilkan katalase yaitu enzim yang mengkonveksi H₂O₂ menjadi H₂O dan koagulase, enzim yang menyebabkan fibrin berkoagulasi dan menggumpal. Koagulase diasosiasikan dengan patogenitas karena penggumpalan fibrin ynag disebabkan oleh enzim, enzim ini terakumulasi di sekitar bakteri sehingga agen perlindungan inang kesulitan mencapai bakteri dan fagositosis terhambat.

Cara kerja

a.      Metode rujukan

      Bakteriologikal Analitical Manual Online Januari 2001. Chapter 12. Staphylococcus aureus.

b.      Peralatan

1)      Meja kerja steril

2)      Cawan petri

3)      Pipet ukur 1ml

4)      Pipet 10 ml

5)      Botol pengencer berulir

6)      Batang gelas bengkok (hocky stick)

7)      Wadah pipet dan cawan petri

8)      Waterbath

9)      Inkubator suhu 35 ± 1ºC

10)  Timbangan

11)  Vortex

12)  Kantong plastik steril

13)  Stomacher

14)  Bunsen

15)  pH meter

16)  Magnetik stirer

17)  Autoklaf

18)  Lemari steril (Laminar flow)

19)  Hot plate stirer

c.       Media dan pengencer

1)      Media dan Pengencer

a)    Baird Parker Agar (BPA)

b)   Egg yolk tellurite emulsion

c)    Tryptic Soy Agar (TSA)

d)   Brain Heart Infusion (BHI) broth

e)    Koagulase plasma kelinci (coagulate rabbit plasma) dengan EDTA 0,1%

f)     Butterfiled’s phosphate Buffered (BPB)

d.      Persiapan contoh

1)      Makanan padat dan semi padat

a)      Diaduk contoh secara merata dengan menggunakan spatula atau alat lain sebelum pengambilan contoh uji.

b)      Ditimbang 50 g contoh secara aseptis dan diinkubasikan ke dalam erlenmeyer yang telah berisi 450 ml larutan Butterfiled’s phosphate Buffered  sehingga diperoleh pengenceran 1:10.

c)      Dihomogenkan dengan stomacher selama 2 menit. Ini merupakan larutan dengan pengenceran 10^-1, kemudian dibuat pegenceran 10^-1,10^-2,10^-3 dan seterusnya.

2)      Minuman atau makanan cair

a)      Diaduk contoh secara merata dengan menggunakan spatula atau alat lain sebelum pengambilan contoh uji.

b)      Contoh yang diuji mulai dari pengenceran 10⁰ (contoh tanpa pengenceran)

c)      Dilakukan pengenceran 10^-1 dengan mengambil 25 ml contoh dan diencerkan dengan 225 ml larutan pengencer Butterfiled’s phosphate Buffered.

d)      Kemudian dibuat seri pengenceran 10^-2, 10^-3 dst, dengan menggunakan larutan Butterfiled’s phosphate Buffered.

e.      Pengujian Staphylococus aureus dengan Metode Hitung Cawan (Metode Sebar)

      Pengujian selalu disertai dengan penggunaan kontrol positif dan negatif. Dituang media BPA yang sudah ditambah dengan (egg yolk telurite emulsion) pada masing-masing cawan yang akan digunakan dan biarkan sampai memadat. Dipipet 1 ml suspensi dari setiap pengenceran dan diinokulasikan, diratakan suspensi contoh diatas permukaan media agar dengan menggunakan batang gelas bengkok (hockey stick). Diinkubasikan pada temperatur 35 ºC selama 45-48 jam pada posisi terbalik.

f.        Perhitungan dan pengamatan

1)      Dipilih cawan petri yang mengandung 20-200 koloni. Apabila cawan petri pada pengenceran terendah berisi <20 koloni maka gunakan hasil perhitungan ini. Jika cawan dengan poengenceran tertinggi berisi >200 dan koloni tipikal tidak muncul maka gunakan cawan ini untuk menghitung Staphylococcus aureus tetapi jangan perhitungan koloni atipikal.

2)      Koloni Staphylococcus aureus mempunyai ciri khas bundar, licin dan halus, cembung, diameter 2-3mm, bewarna abu-abu sampai hitam pekat, dikelilingi zona opaqe, dengan atau tanpa zona terang  (clear zone). Konsistensi koloni seperti metega atau lemak jika disentuh dengan ose. Galur non-lipolitik mempunyai sifat koloni separti di atas, tetapi tidak dikelilingi zona opaqe dan zona luar yang terang

3)      Dicatat jumlah masing-masing koloni yang mempunyai ciri seperti pada poin 7 diatas.

4)      Diambil satu atau lebih koloni dari masing-masing bentuk yang tumbuh dan lakukan uji identifikasi.

g.      Uji identifikasi dengan Uji koagulase

      Iokulasikan koloni yang diduga Sthypilococus aureus, ambil satu koloni penuh masukan dalam Brain Heart Infusion Broth (BHIB), dari BHI inokulasikan ke media Trypto Soya Agar (TSA) kemudian BHI dan TSA di inkubasikan disuhu 37°C selama 24 jam,tambahkan BHI dengan plasma kelinci yang telah di tambah dengan EDTA 1%, inkubasikan kembali pada suhu 37ºC selama 24-48 jam amati setiap 6 jam. Jika positif akan membentuk gumpalan seperti agar yang apa bila di balik tidak akan bergerak jatuh.

h.      Perhitungan

      Dihitung jumlah koloni yang menunjukan koloni khas Staphylococcus aureus dan menunjukan hasil dari uji koagulase positif dengan perhitungan sebagai berikut:

N =                 ∑C  x  d      .

            [(1xn₁) + (0,1 x n₂)]

      Dimana :

N   = adalah jumlah koloni per g atau ml produk

∑C = adalah koloni dari tiap-tiap petri

n₁   = jumlah cawan petri dari pengenceran pertama yang dihitung

n₂    = jumlah cawan petri dari pengenceran kedua

d    = pengenceran pertama yang dihitung

Hasil dilaporkan sebagai jumlah Staphylococcus aureus per ml atau per gram . (koloni/ ml atau koloni / g).

L.     Analisa Escherichia coli

      Eschericia coli atau biasa disingkat E.Coli, adalah sepesias gram negatif. Pada umumnya, bakteri yang ditemukan oleh Theodor Ecsherich ini dapat ditemukan dalam usus besar manusia. Kebanyakan Eschericia coli tidak berbahaya, tetapi beberapa separti Eschericia coli tipe O157:H7, dapat mengakibatkan menyebabkan keracunan makanan yang serius pada manusia. Eschericia coli yang tidak berbahaya dapat menguntungkan manusia karena dapat memproduksi vitamin K₂ atau dengan mencegah bakteri lain di dalam usus. Eschericia coli banyak digunakan dalam teknologi rekayasa genetika. Biasa digunakan sebagai vaktor untuk menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan untuk dikembangkan, Eschericia coli dipilih karena pertumbuhanya sangat cepat dan penangananya mudah.

Escherichia coli entropatogenik

      Keracunan makanan yang disebabkan oleh Eschericia coli patogenik (EPEC) biasanya disebabkan oleh konsumsi makanan atau minuman yang terkontaminasi oleh Eschericia coli penyebab entiritis. EPEC berbeda bengan Eschericia coli secara normal berada di usus besar. EPEC mempunyai antigen spesifik tertentu dan menyebabkan gastroenteritis akut atau enteritis seperti disentri pada menusia. Yang tergolong EPEC termasuk Eschericia coli yang bersifat invasif atau disebut EIEC (Entro Invansif E.Coli) dan Eschericia coli entrotoksigenik yang disebut juga ETEC. EIEC dapat menembus sel-sel saluran pencernaan seperti halnya Shigella, sedangkan ETEC memproduksi entrotoksin yang bersifat separti toksin kolera.

      Eschericia coli adalah salah satu gram negatif berbentuk batang, bersifat anaerobik fakultatif dan mempunyai flagela peritrikat. Eschericia coli dibedakan sesuai sifat serologinya berdasarkan antigen somatik (O), kapsul (K) dan flagele (H). Enterotoksin yang diproduksi oleh ETEC dapat dibedakan atas dua macam,  yaitu :

1.      Enterotoksin yang tahan panas disebut ST yaitu singkatan dari “ Stable Toxin”.

2.      Enterotoksin yang tidak tahan lama disebut LT yaitu singkatan dari “Labile Toxin”. ST masih aktif setelah pemanasan pada suhu 100ºC selasma 30 menit. bakteri yang bersifat enterotoksigenik memproduksi salah satu atau kedua macam toksin tersebut.

Cara kerja

a.      metode rujukan

1.      Baktriological Analytical Manual Online september 2002. Chapter 4. Enumeration of Escherichia coli and the coliform Bakteria. Food and Drug Administration.

2.      SNI 01-2332.1-2006. Cara uji mikrobiologi-bagian1: Penentuan koliform dan Escherichia coli pada produk perikanan. Badan standatisasi

3.      SNI 01-3751-2006. Tepung terigu sebagai bahan makanan. Badan standarisasi nasional

b.      Peralatan

1)      Penangas air bertutup dengan sirkulasi 45 ± 0,5ºC

2)      Inkubator 35 ± 1 ºC

3)      Timbangan

4)      Stomacher

5)      Pipet 10 ml

6)      Peralatan steril penanganan sampel (gunting, pinset, kantung plastik,dll)

7)      Botol pengencer

8)      Tabung durham

9)      Cawan petri

10)  Tabung reaksi bertutup ulir ukuran 16 x 150 mm dan 13 x 100 mm

11)  Mikroskop

12)  Gelas objek

13)  Tabung pengencer

14)  Jarum ose

15)  Pembakar bunsen

16)  Magnrtik stirer

17)  Pengocok tabung (vortex)

18)  Autoklaf

19)  Lemari steril (laminar flow)

20)  Waterbath

21)  Refrigerator

c.       Media dan Pengencer

a.       Lauryl Sulphate Tryptose Broth (LSTB)

b.      Escherichia coli broth  (ECB)

c.       Levine’s Eosine Methylen Blue Agar (EMBA)

d.      Triptone Broth (TB)

e.       Butterfiled’s phosphate buffered

f.        MR – VP broth

g.       Indikator Methyl red

h.       Simmon Citrat Agar (SCA)

i.         Plate Count Agar (PCA)

j.        Pereaksi kovcs

k.      Pereaksi voges proskauer

l.         Larutan a naphtol

m.     Larutan KOH 40% 1

d.      Persiapan Contoh

1)      Diaduk contoh secara merata dengan menggunakan spatula steril atau alat lain sebelum pengambilan contoh dilakukan.

2)      Dilakukan pengenceran 10^-1 dengan mengambil 10 ml contoh dan diencerkan dengan 90 ml larutan pengencer Butterfiled’s phosphate buffered. Dihomogenkan dengan stomacher selama 2 menit.

3)      Dilakukan pengenceran selanjutnya dengan menggunakan larutan Butterfiled’s phosphate buffered.

4)      Contoh yang diuji mulai dari pengenceran 10⁰ contoh tanpa pengencer, untuk produk cair dan untuk produk semi padat atau padat dimulai dari pengenceran 10¹, seperti pada Gambar 6.

 

Gambar 6. Cara pengenceran 3 seri tabung

e.      Pengujian dengan menggunakan Angka Paling Mungkin (APM)

ü      Digunakan metode APM 3 seri tabung untuk pengujian produk pangan selain air minum dalam kemasan.

ü      Tahap pengujian adalah sebagai berikut :

1)      Uji pendugaan

Dilakukan menggunakan media LSTB, diinkubasi pada suhu 35°C

2)      Uji penegasan Escherichia coli

menggunakan media EC. Broth, diinkubasi di waterbath pada suhu 45°C

3)      Uji morfologi

                           menggunakan media PCA

4)      Uji biokimia

Terdiri dari uji indol, Methyl red, Voges Proskauer, sitrat dan uji produksi gas laktosa.

f.        Interpretasi Hasil

Tabel 9. Interpretasi hasil uji IMVIC

Type	Indol	Methyl Red	Voges Proskauer	Citrate
Escherichia coli
Varitas I	+	+	-	-
Varitas II	-	+	-	-

g.      Pelaporan

Berdasarkan interpretasi hasil diatas nyatakan Escherichia coli dalam
APM/g dengan menggunakan Angka paling Memungkinkan (APM) dengan merujuk

pada Tabel 10. Apabila menggunakan 3 tabung.

Tabel 10.   APM Escherichia coli

Tabung Positif			APM/g	TK kepercayaan		Tabung positif			APM/g	TK kepercayaan
0.1	0.01	0.001		Bawah	Atas	0.1	0.01	0.001		Bawah	Atas
0	0	0	<3.0	--	9.5	2	2	0	21	4.5	42
0	0	1	3	0.15	9.6	2	2	1	28	8.7	94
0	1	0	3	0.15	11	2	2	2	35	8.7	94
0	1	1	6.1	1.2	18	2	3	0	29	8.7	94
0	2	0	6.2	1.2	18	2	3	1	36	8.7	94
0	3	0	9.4	3.6	38	3	0	0	23	4.6	94
1	0	0	3.6	0.17	18	3	0	1	38	8.7	110
1	0	1	7.2	1.3	18	3	0	2	64	17	180
1	0	2	11	3.6	38	3	1	0	43	9	180
1	1	0	7.4	1.3	20	3	1	1	75	17	200
1	1	1	11	3.6	38	3	1	2	120	37	420
1	2	0	11	3.6	42	3	1	3	160	40	420
1	2	1	15	4.5	42	3	2	0	93	18	420
1	3	0	16	4.5	42	3	2	1	150	37	420
2	0	0	9.2	1.4	38	3	2	2	210	40	430
2	0	1	14	3.6	42	3	2	3	290	90	1,000
2	0	2	20	4.5	42	3	3	0	240	42	1,000
2	1	0	15	3.7	42	3	3	1	460	90	2,000
2	1	1	20	4.5	42	3	3	2	1100	180	4,100
2	1	2	27	8.7	94	3	3	3	>1100	420	--

M.  Analisa Coliform

      Coliform merupakan suatu grup bakteri yang digunakan sebagai indikator adanya polusi kotoran dan kondisi sanitasi yang tidak baik terhadap air, makanan, susu dan produk-produk susu. Adanya Coliform didalam suatu makanan atau minuman menunjukan adanya bakteri lain yang bersifat enteropatogenik dan/ toksigenik yang berbahaya bagi kesehatan.

1.      Coliform fekal, misalnya Escherichia coli

2.      Coliform non fekal, misalnya Enterobacter aerogenes. Escherichia coli merupakan bakteri yang berasal dari kotoran hewan maupun manusia, sedangkan E.aerogenes biasanya ditemukan pada hewan atau tanaman-tanaman yang sudah mati.

      Untuk mengetahui jumlah Coliform didalam contoh biasanya digunakan metode MPN (Most Probable Number) dengan cara fermentasi tabung ganda. Metode ini lebih baik dari pada metode hitung cawan karena lebih sensitif dan dapat mendeteksi Coliform dalam jumlah yang rendah pada suatu sampel. Metode lain yang dapat digunakan untuk menghitung Coliform yaitu  Millipore Membrane- Filter (MF) yang dapat mendeteksi dan menghitung Coliform dalam jumlah yang sangat kecil dalam suatu sampel.

Uji kualitatif Coliform secara lengkap terdiri dari tiga tahap yaitu :

1.      uji penduga

2.      uji penguat

3.      uji lengkap

uji penduga juga merupakan uji kuantitatif Coliform menggunakan metode MPN. Uji kualitatif Coliform tidak selalu di lakukan secara lengkap, tergantung dari berbagai faktor misalnya waktu, mutu contoh yang di uji, biaya, tujuan analisa, dan faktor–faktor lainya.

Cara kerja

a.      Metode rujukan

1)      Bakteriological Analitical Manual Online September 2002. Chapter 4. Enumeration of Escherichia coli and the coliform Bacteria. Food and Administration.

2)      SNI 01-2332.1-2006. Cara Uji Mikroba –Bagian 1 : penentuan koliform dan escherichia Coli pada produk perikanan. Badan standarisasi.

b.      Peralatn

1)      penangas air bertutup dengan sirkulasi 45 ± 0,5ºC

2)      Inkubator 35 ± 1 ºC

3)      Timbangan

4)      Stomacher

5)      Pipet 10 ml

6)      Peralatan steril penanganan sampel (gunting, pinset, kantung plastik,dll)

7)      Botol pengencer

8)      Tabung durham

9)      Cawan petri

10)  Tabung reaksi bertutup ulir ukuran 16 x 150 mm dan 13 x 100 mm

11)  Mikroskop

12)  Gelas objek

13)  Tabung pengencer

14)  Jarum ose

15)  Pembakar bunsen

16)  Magnrtik stirer

17)  Pengocok tabung (vortex)

18)  Otoklaf

19)  Lemari steril (laminar flow)

20)  Waterbath

21)  Refrigerator

c.       Media dan pengencer

1)      Lauryl Sulphate Tryptose Broth (LSTB)

2)      Brilian Green Lactose Bile Broth (BGLBB)

3)      Buttrfiled’s Phosphate Buffered (BPB)

d.      Persiapan Contoh

1)      Contoh diaduk secara merata dengan menggunakan spatula steril atau alat lain sebelum pengambilan contoh dilakukan.

2)      Dilakukan pengenceran 10^-1 dengan mengambil 50 ml contoh dan diencerkan dengan 450 ml larutan pengencer Buttrfiled’s Phosphate Buffered. Kemudian homogenkan dengan menggunakan Stomacher selama 2 menit.

3)      Dilakukan pengenceran sesuai yang dibutuhkan.

4)      Contoh yang di uji dimulai dari pengenceran 10⁰ (contoh tanpa pengenceran) untuk produk cair, dan 10^-1 untuk produk semi padat dan padat.

e.      Pengujian dengan Menggunakan Metode Angka Paling Mungkin (APM)

Digunakan metode APM 3 seri tabung untuk pengujian produk pangan selain air minum dalam kemasan. Tahap pengujianya adalah sebagai berikut :

1)      Uji pendugaan

Menggunakan media Lauryl Sulphate Tryptose Broth (LSTB)

2)   Uji penegasan

Menggunakan media Brilian Green Lactose Bile Broth (BGLBB)

f.        Pelaporan

      Berdasarkan interpretasi hasil diatas dinyatakan Coliform dalam APG/g dengan menggunakan Angka Paling Memungkinkan (APM ) dengan  merujuk pada Tabel 10 untuk 3 seri tabung.

N.    Analisa Clostridium butyricum (anaerob)

      Clostridium butyricum adalah anaerobik prokariota yang membutuhkan ketiadaan mutlak oksigen untuk tumbuh. Clostridium butyricum  menghasilkan asam butirat yang merupakan indikator adanya Saccharolytic Clostridia. Clostridium butyricum  adalah Endospora  dan dapat hidup dalam kondisi kasar. Ia mendapat energi melalui fermentasi menggunakan granulose sebagai substrat. Dalam analisa mikrobiologi Clostridium butyrikum  digunakan sebagai parameter kadar pengawet minuman dalam kemasan.

Cara kerja

1.      Periksa sampel,  pastikan sampel dalam keadaan baik (tidak sobek atau pecah).

2.      Bersihkan sampel dengan alkohol 70 %.

3.      Sampel disuntikan clostredium butyrikum 1ml.

4.      Encerkan sampel dengan mengambil 1ml sampel kedalam 9ml larutan pengencer vortek hingga tercampur merata (pengenceran 10^-1,10^-2,10^-3 dan seterusnya).

5.      Ambil 1ml suspensi dari setiap pengenceran tersebut masukan dalam cawan petri steril.

6.      Tuangkan media Reincforced Clostridial Medium (RCM) kedalam cawan petri tersebut, ratakan dengan cara mengoyang-goyangkan cawan petri hingga media tercampur merata dengan sampel.

7.      Masukan cawan dalam camber dalam posisi terbalik.

8.      Pasang katalis anoxomat yang telah disterilisasi kering (di oven).

9.      Tutup camber dengan rapat menggunakan pengunci, setelah semuanya selesai camber di anoxomat.

Cara menggunakan anoxomat

1.      Pasang kabel ke aliran listrik

2.      Tekan tombol ON

3.      Pasang selang anoxomat ke camber

4.      Buka penngungkit gas pada anoxomat dengan cara memutar berlawanan dengan arah jarum jam dan buka pengunci selang.

5.      Pada layar anoxomat akan muncul tampilan Gambar 7

Pilih anaerobic 0% O₂ , START

6.      Akan muncul tampilan seperti pada Gambar 8

Mekanisme kerja anoxomat

ü      Gas comen : tekanan gas yang digunakan minimal 1,69 Br apabila tekanan gas kurang dari 1,69 Br akan terdapat tanda silang (X), apabila gas telah sesuai akan terdapat tanda (V) dan anoxomat akan mengevakuasi O₂  dalam camber dan di ganti dengan gas Hidrogen (H₂ 10%), Carbondioksida(CO₂ 10%) dan Nitrogen (N₂ balanc).

ü      Setelah evakuasi akan dilakukan pengontrolan sill, katalis dll apabila semua dalam keadaan baik akan terdapat tanda (V) dan akan muncul tulisan “Ready” lalu tekan “start”.

 

                        Gambar 3. Tampilan pertama dalam anoxomat 

 

               

          

                                    Gambar 4. Tampilan dalam anoxomat

BAB IV

PEMBAHASAN

A.     Sanitasi

      Sanitasi adalah upaya yang dilakukan untuk menjamin kondisi  yang memenuhi persyaratan kesehatan. Untuk mencegah terjadinya kontaminasi, kondisi steril perlu diterapkan, terutama pada tempat kerja (ruang kerja dan laminar) pengujian ini disebut analisa densitas ruang dan laminar. Analisa ini biasanya menggunakan metode tuang namun tak jarang yang menggunakan metode oles (Swab). Pada analisa ini ruangan dan laminar masih dikatakan bagus apabila mikroba yang tumbuh pada media PCA maksimal percawan 15 koloni per 15 menit. Analisa densitas mikroba menggunakann media PCA karena pada media ini semua jenis bakteri, kapang dan khamir akan tumbuh, karena udara yang terkontaminasi memungkinkan mengandung berbagai mikroba termasuk kapang dan khamir.

B.     Kerja Aseptik

      Dasar digunakan teknik aseptik adalah adanya banyak partikel debu yang mengandung mikroorganisme (bakteri atau spora) yang mungkin dapat masuk ke dalam cawan, mulut erlenmeyer, atau mengendap di area kerja. Pertumbuhan mikroba yang tidak diinginkan ini dapat mempengaruhi atau mengganggu hasil dari suatu percobaan. Mikroorganisme dapat juga ”jatuh” dari tangan analis, sarung tangan atau jas laboratorium karena pergerakan lengan yang relatif cepat. Penggunaan teknik aseptik bertujuan meminimalisir material yang digunakan terhadap agen pengontaminasi.

C.     Persiapan media dan sampel

      Media yang sering digunakan adalah media (tunggal) atau media (jamak). Media dibedakan atas tiga macam yaitu : (1) media cair yang dapat digunakan untuk berbagai tujuan termasuk menumbuhkan dan membiakkan mikroba, fermentasi, dan uji-uji lainnya, misalnya Nutrient Broth, Glucose Broth, dan lainsebagainya, (2) media padat ,misalnya Nutrient Agar, Plate Count Agar,atau Potato Dextrose Agar, yang dapat digunakan untuk menumbuhkan mikroba pada permukaan sehingga membentuk koloni yang dapat dilihat, dihitung atau diisolasi,dan (3) media setengah padat (semi solid) yang mempunyai konsistensi diantara media cair dan media padat. Pada saat pembuatan media peralatan yang digunakan harus dalam kondisi bersih agar tidak memungkinkan media akan terkontaminasi setelah di otoklaf atau disterilisasi.

      Dalam analisa mikrobiologi dalam persiapan sempel harus dilakukan dengan steril didekat nyala bunsen, selain perlakuan yang steril peralatn yang digunakan juga harus dalam kondisi steril juga agar sampel tidak terkontaminasi peralatan yang kotor. Selain itu analis harus memakai perlengkapan praktikum bersih dan lengkap,seperti jas lab, hairnet, masker,sarung tangan yang telah disemprot alkohol. Hal ini dimaksutkan agar mikroba yang dianalisa murni dari sampel. Sampel yang akan dianalisa umumnya ada 3 macam jenis yaitu sampel dalam keadaan beku, makanan pedat dan semi padat, minuman atau makanan cair.

D.     Pengujian Angka Lempeng Total

      Prinsip analisa angka lempeng total dalah menumbuhkan bakteri mesofil aerob setelah contoh uji di tuang atau digores pada media Plate Count Agar (PCA) dan diinkubasikan pada suhu 35 ± 1°C selama 24-48 jam. Media PCA merupakan media yang tidak selektif sehingga analisa ini dilakukan untuk mengisolasi mikroba dalam contoh yang diuji. Mikroba yang tumbuh bisa bakteri, kapang khamir, dan bakteri pembentuk spora. Dalam pengujian ini pada saat inkubasi cawan diletakan pada kondisi terbalik karena pada suhu 35°C media akan menguap dan akan mempengaruhi pertumbuhan mikroba. Dalam pengujian koloni yang dihitung antara 25-250 koloni.

E.     Pewarnaan Microba

      Pewarnaan yang dilakukan di SEAFAST Center ada 2 macam pewarnaan yaitu pewarnaan gram dan pewarnaan endospora. Pada saat pewarnaan, pengambilan suspensi mikroba yang akan difiksasi sedikit saja dan diratakan agar memudahkan dalam pewarnaan dan pengamatan

      Proses pewarnaan gram dapat dilakukan sebagai berikut: ambil air steril dengan menggunakan ose yang telah membara (ambil sedikit saja), ambil suspensi mikroba oleskan pada Slides dan ratakan, fiksasi, pewarnaan dengan menggunakan kristal violet 1menit, pencucian dengan air (dicuci pada air mengalir, posisi Slides miring dan dilakukan secara hati-hati agar mikroba tidak terbawa air), pewarnaan dengan lugol selama 1 menit agar warna diserap microba secara sempurna, cuci dengan menggunakan alkohol selama 10-20 detik untuk mnghilangkan zat warna yang tidak diserap oleh dinding sel mikroba (pencucian dengan menggunakan alkohol tidak boleh terlalu lama karena akan melunturkan zat warna yang telah diserap oleh dinding sel mikroba, kemudian dilakukan pencucian dengan aquadest dan selanjutnya diwarnai dengan menggunakan (Counterstain) yaitu safranin 10-20 detik diuci dengan menggunakan aquadest kembali dan dikeringkan menggunakan tissue (kertas serap) setelah itu diamati dengan menggunakan mikrockop dengan lensa objektif  minyak imersi. Bakteri gram positif dan gram negatif didasarkan pada struktur dinding sel. Sel-sel yang tidak dapat melepas warna kristal violet yaitu biru ungu disebut bakteri gram positif, sedangkan sel-sel yang dapat melepaskan kristal violet dan mengikat safranin sehingga bewarna merah disebut bakteri gram negatif.

      Sedangkan prinsip pewarnaan endospora adalah untuk membedakan spora dari sel vegetatif. Ambil sedikit dari koloni goreskan pada Slides, teteskan pewarna hijau malasit green diteteskan diatas nyala flm tersebut dan biarkan selama 20 menit tanpa pemanasan atau 5 menit daiatas penangas air. Hal ini dilakukan karena spora pada umumnya akan sulit menyerap zat warna sehinga zat warna akan terserap cukup lama dan sekali menyerap zat warna akan sulit melepaskan zat warna tersebut. Setiap kali zat warna kering tetesi lagi. Kemudian dicuci secara heti-hati dengan menggunakan aquadest selama 20-30 detik atau sampai warna hijau tidak luntur. Slide ditetesi dengan menggunakan safranin (untuk mewarnai sel) selama 30 detik, bilas dendan aquadest dan keringkan dengan tissu atau kertas serap. Kelemahan disini adalah sedikit sel yang dapat diwarnai oleh zat warna pembanding dimana sudah dijelaskan tadi apabila sel telah menyerap suatu zat warna maka akan sukar menyerap zat warna lain. Kemudian objek diamati dengan menggunakan mikroskop lensa objektif dengan minyak imersi bakteri endospora akan bewarna hijau-hijau muda, sedangkan sel vegetatif bewarna merah-marah muda. Diamati bentuk dan besar spora, letak spora didalam sel, pembengkakan sel vegetatif atau spora mungkin akan dikeluarkan dari sel apabila kultur yang diamati sudah terlalu tua.

F.      Pembuatan Kultur Kapang pada Glas Obyek (Slide Cultur)

      Tujuan pembuatan kultur dengan gelas obyek ini adalah untuk melihat pertumbuhan kapang yang masih hidup untuk di amati menggunakan mikroskop. Cara yang digunakan yaitu sebuah cawan petri diberi alas kertas saring sehingga alas bagian bawah cawan tertutup. Suatu batang glas berbentuk U atau V diletakan didalamnya dan diatasnya diletakan glass obyek berdampingan dengan glas penutup (gelas penutup diletakan dalam keadaan miring agar mudah di ambil). Cawan tersebut disterilkan didalam otoklaf (sterilisasi basah). Setelah dingin diatas gelas obyek ditetesi medium cair steril yaitu Potato DexTrose Agar / Malt Exstract Agar atau Glucose Agar. Diratakan dengan loop atau batang gelas steril sehingga membentuk lapisan tipis dengan luas tidak melebihi gelas penutup dan biarkan membeku didalam cawan tertutup. Setelah membeku, permukaan agar diinokulasi dengan sedikit spora kapang dengan menggunakan ose, kemudian tutup dengan gelas penutup steril. Sebanyak 5-7 ml gliserol 10% steril diteteskan di atas kertas filter untuk memberikan kelembaban yang optimum selama pertumbuhan kapang, inkubasi dilakukan pada suhu kamar selama 3-5 hari, kemudian struktur kapang diamati menggunakan mikroskop, mula-mula dengan pembesaran rendah (100 kali) kemudian dengan pembesaran tinggi (400 kali,high dry).

G.    Pemeliharaan Kultur (Di agar miring dan manik-manik)

      Pengawetan dengan menggunakan agar miring merupakan pengawetan kultur dengan jangka pendek yaitu setiap 3minggu sekali harus dilakukan penyegaran kembali. Penyimpanan yang terlalu lama ditakutkan akan merubah sifat pada mikroba atau kematian pada mikroba tersebut. Pengawetan mengunakan agar miring dilakukan dengan cara mengores kultur ke media agar miring dan di inkubasi, apabila mikroba yang digores telah tumbuh, disimpan dalam Refrigerator, atau pada suhu ruang tetapi dengan menambahkan mineral oil untuk menjaga kelembabanya.

      Pengawetan dengan menggunakan manik-manik, merupakan pengawetan jangka panjang. Pengawetan dengan cara ini, manik-manik berfungsi untuk menjerat mikroba yang diawetkan. Manik-manik yang digunakan bisa manggunakan manik-manik khusus atau  manik-manik biasa,tetapi lebih bagus menggunakan manik-manik khusus karena didisain untuk menjerat mikroba.Pengawetan dengan menggunakan manik-manik mempunyai keuntungan yaitu daya simpan kultur dapat mencapai satu tahun. Sehingga dapat digunakan berkali-kali serta akan menghemat bahan, waktu dan biaya. Dalam pengujian alat dan bahan harus dalam keadaan steril. Setelah kuvet diisi dengan kultur murni maka perlu didiamkan selama 2-3 jam, ini dilakukan untuk menjerat mikroba pada libang / sela-sela dari manik-manik atau akan menempel pada dinding kuvet. Tambahkan ngliserol untuk menjaga kelembaban mikroba saat penyimpanan.

H.    Analisa Kapang Kamir

      Analisa kapang khamir umumnya menggunakan media Potatto Dextrose Agar (PDA) dengan penambahan Khlorapenikol 1% atau asam tartarat 10 % dengan inkubasi pada suhu 30°C atau suhu kamar selama 5 hari. fungsi dari khlorapenikol dan asam tartarat adalah sebagai penghambat pertumbuhan bakteri dimana secara umum bakteri tidak akan tumbuh atau tahan pada pH 4,5 (asam) sedangkan kapang dan khamir akan tetap tumbuh. Sebenarnya dengan adanya antibiotik dan asam tartarat pertumbuhan kapang dan khamir akan terhambat, kapang dan khamir akan tumbuh kecil-kecil. Kapang umumnya lebih tahan dari pada khamir, karena kapang masih dapat bertahan pada suhu dan kondisi ekstrim sedangkan khamir tidak. Perbedaan pengunaan khlorapenikol dan asam tartarat adalah dengan penambahan asam tartarat kapang dan khamir akan tumbuh subur dan bakteri tidak akan tumbuh karena dengan penambahan asam tartarat media akan menjadi lebih selektif, sedangkan dengan penambahan antibiotik khlorapenikol hanya akan menghambat pertumbuhan bakteri sehingga ada kemungkinan bakteri masih dapat tumbuh

I.       Analisa Salmonella

      Prinsip pertumbuhan Salmonela selektif  dan dilanjutkan dengan uji biokimia dan uji serologi. Sampel dilakukan analisa selama 36 jam (maksimal) untuk sempel segar seperti jenis lauk (makanan) dihitung dari waktu kedatangan, dan untuk sampel beku tidak boleh lebih dari 1 minggu. Pada saat pengujian sempel berada pada kondisi ruang maksimal 15 menit setelah diencerkan. Dengan tujuan agar sampel tidak mengalami perubahan sifat atau sampel terkontaminasi dengan lingkungan sekitar. Ada beberapa jenis Salmonela yang menyebabkan panyakit yaitu salmonela  triphimorin dan salmonela enteridish yang menyebabkan penyakit salmonelosis. Sumber infeksi yang diserang oleh Salmonela adalah jenis makanan hewani seperti sosisikan dan telur. Makanan tersebut kerkontaminasi salmonella dari lalat, kecoa dan tikus. Salmonela dapat tumbuh pada media Lactose Broth (LB) dapat mencapai 10^-5-10^-7 koloni/ml. Pada uji biokimia terdapat uji Urease, Indol, VP, Methyl red, Sitrat, LDB, KCN. Namun yang biasa dilakukan hanya uji indol, VP, Methyl red, sitrat (IMVIC), karena uji-uji tersebut sudah mewakili hasil.

J.      Analisa Staphylococus aureus

      Pertumbuhan bakteri Staphylococus aureus  terjadi pada pembenihan khusus setelah diinkubasi pada suhu 35°C selama 24-48 jam dan dilanjutkan dengan uji koagulase dengan plasma kelinci. Pada analisa ini media yang digunakan adalah Baird Parker Agar  (BPA) yang ditambah dengan egg yolk tellurite emultion yang berfungsi menumbuhkan bakteri ini dengan baik. BHIB, EDTA 0,1 %. Pada pengujian ini dilakukan dengan metode sebar karena bakteri ini merupakan bakteri aerobik (membutuhkan udara untuk tumbuh) sedangkan metode tuang  digunakan untuk  bakteri mikro aerobik (sedikit membutuhkan udara). Pengujian dengan mengunakan metode ini harus disertai dengan kontrol positif.

K.    Analisa Escherichia coli

      Pada analisa Escherichia coli media yang diguanakan adalah Lauryl Sulphate Tryptose Broth  (LSTB) dan  Escherichia coli broth (ECB) ditandai dengan terbentuknya gas dalam tabung durham dan ditandai dengan kekeruhan setelah di inkubasikan pada suhu 45°C selama 24-48 jam, selanjutnya merujuk kepada tabel APM, yang diikuti dengan uji morfologi menggunakan media  Plate Caunt Agar (PCA) dan uji biokimia yaitu diantaranya uji indol, Methyl red, Voges Proskauer, Sitrat dan uji produksi gas laktosa. Pada pengujian  Escherichia coli dapatjuga menggunakan metode MPN/ metode tuang. Koloni yang diduga kurang dari 100 koloni biasanya pada pengenceran 10^-1 menggunakan duplo stereght. Hal ini dimaksudkan untuk mendapat hasil yang valid. Analisa E. Coli pada makanan dan minuman berpengawet, kadang-kadang  E. Coli muncul pada pangkat yang lebih tinggi dikarenakan E. Coli akan tumbuh karena pada pangkat yang lebih tinggi sedikit zat pengawet yang tersisa.

L.     Analisa coliform

      Prinsip analisa pada coliform sama dengan enalisa escherichia coli yaitu terbentuknya gas pada tabung durham dan kekeruhan saat penggunaan media Lauryl Sulphate Tryptose Broth  (LSTB) dan media Brilian Green Bile Broth (BGBB). Perbedaan analisa E. Coli dan Coliform yaitu ada pada media Brilian Green Bile Broth (BGBB). Pada media BGBB E. Coli juga masih dapat tumbuh karena E. Coli merupakan golongan dari Coliform fekal.  tetapi media ini tidak spesifik untuk E. Coli, media BGBB hanya selektif untuk pertumbuhan Coliform

M.  Analisa Clostredium (anaerob)

      Dalam analisa Clostridium butyricum ini media yang digunakan adalah Reincforced Clostridial Medium (RCM) karena media ini selektif untuk analisa anaerobic. Analisa ini menggunakan alat yang bernama anoxomat  yaitu alat khusus untuk analisa  anaerobic. Bakteri Clostridium butyricum ini didalam analisa mikrobiologi umumnya digunakan untuk mengetahui kadar pengawet yang digunakan dalam minuman kemasan (AMDK)

BAB V

KESIMPULAN

      Pengujian mikrobiologi selama praktek industri yang dilakukan di SEAFAST Center adalah pengujian tentang analisa Salmonella, Escherichia coli, staphylococus aureus, Coliform, Clostridium butyrikum, pembuatan pewarnaan gram, pembuatan kultur kapang pada gelas obyek, kultur mikroba dan cara isolasi. Analisa tersebut adalah analisa yang umum dilakukan untuk makanan.

      Dalam setiap analisa harus dilaksanakan sesuai persyaratan GLP (Good Laboratorium Practice) yaitu dengan memakai perlengkapan pelindung diri separti jas leb, hairnet, masker, dan sarung tangan. Selain itu dalam analisa mikrobiologi harus dilakukan secara aseptis dan steril agar tidak terjadi kontaminasi oleh mikroba lain.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim.2010. Mikrobiologi Umum .Fakultas Teknologi Pertanian. IPB- Bogor.

Anonim.2010. Instruksi Kerja Analisa Mikrobiologi .SEAFAST Center. IPB-Bogor

Fardiaz, srikandi. 1989. Petunjuk Laboratorium Analisa Mikrobiologi Pangan.Lembaga Sumberdaya Informasi IPB-Bogor.

Kusumaningrum, HD, CC Nurwitri, dkk.2007. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Pangan. LDITP. IPB-Bogor.

Rachmawan obin. 2001. Modul Sumber Kontaminasi dan Teknik Sanitasi. direktorat

Menengah Kejuruan. Jakarta.

Rahayu, Winiati Pudji, Lilis Nuraida, dkk.2010. Penuntun Mikrobiologi Pangan. PAU Pangan dan Gizi. IPB-Bogor.

www.wikipedia.com

http://ekmon-saurus.blogspot.com/2011/03/tabel-mpn-3-seri-5-seri-tabung.html

Lampiran 1. Komposisi Larutan

1.   larutan pengencer(bufer fosfat)

ü      Larutan stok

v           KH₂PO₄                                                     34 g

v           Air destilata                                                500 g

v           pH diatur menjadi                                       1N

v           Diencerkan dengan air destilata sampai 1000 ml

ü      Larutan pengencer

v           Larutan stok bufer fosfat                             1,25 ml

v           Larutan stok MgSO₄                                  5 ml

v           Air destilata sampai 1000 ml

ü      Larutan stok magnesium sulfat

v           Kristal MgSO₄ . 7H₂O                                50 g

v           Air destilata                                                1000 ml

2.   Gram pewarna

ü      Larutan kristal violet

v           Kristal violet                                               2 g

v           Etil alkohol                                                 20 ml

v           Larutan diatas dicampur dengan

v           Amonium oksalat                                        0,8 g

v           Air destilata                                                80 ml

ü      Larutan iodium

v           Kristal iodium                                             1 g

v           Kalium iodida                                             2 g

v           Air destilata                                                300 ml

ü      Larutan safranin

v           Safranin O (2,5 % larutan alkohol)              10 ml

v           Air destilata                                                100 ml

3.   larutan pereaksi , kovac

v           P-dimetilaminobenzenaldehida                     5 ml

v           Amil alkohol                                               75 ml

v           HCL pekat                                                 25 ml

4.      Levowitz-weber,larutan pewarna

v           Methylene blue khlorida                              6 g

v           Etil alkohol 95%                                         52 ml

v           Tetrakhoretana                                           44 ml

Bahan-bahan tersebut dicampur dan dibiarkan selama 24 jam pada suhu 7ºC dan disaring dengan kertas saring whatman no 42.

v           Tambahkan asam asetat glasial                    4 ml

5.      voges-proskuer, pereaksi

ü      larutan alfa-naftol

v           Alfa-naftol                                                  5 g

v           Etil alkohol 95%                                         100 ml

ü      Larutan KOH

v           KOH                                                         40 g

v           Air destilata                                                100 ml

ü      Kreatin                                                                0,2 ml

6.      Tartarat 10%

v           Asam tartarat                                              10 ml

v           Air destilata sampai                                     100 ml

7.      Natrium Hidroksida 4%

v           NaOH                                                        4 g

v           Air destilata                                                100 ml

8.      Malachite Green

v           Malachite green                                          5 g

v           Air destilata                                                100 ml

9.      Methylene Blue

v           Methylene blue                                           0,3 g

v           Air destilata                                                100 ml

10.  Natrium sitrat

v           Na-sitrat                                                     2 g

v           Ait destilata                                                100 ml

11.  Loeffer’s Methylene Blue

v           Methylene blue 90 %                                  0,3 g

v           Etil alkohol 95%                                         30 ml

v           Larutan diatas dicampur dengan KOH encer (0,01 % b/v) 200 ml

Lampiran 2. Struktur Organisasi SEAFAST Center

1.	Director	:	Prof. Dr. Ir. Purwiyatno Hariyadi, MSc
2.	Executive Secretary	:	Dr. Ir. Nuri Andarwulan, MSi
3.	Program Manager	:	Dr. Ir. Lilis Nuraida, MSc
4.	Coordinator of promotion and Public Relation	:	Dr. Ir. Nurheni Sri Palupi, MSi
5.	Program Coordinator for Nutrition Improvement	:	Dr. Ir. Siti Madanijah, MS
6.	Program Coordinator For Improving Quality and Safety of Food	:	Dr. Ir. Ratih D Hariyadi, MSc
7.	Program Coordinator for Food Adequency (Food Security)	:	Dr. Dahrul Syah
8.	Quality Manager	:	Dr. Eko Hari Purnomo, STP., MSc

Lampiran 3. Foto Pengamatan Pengujian

Pengujian salmonella

         LB (+)

HEA,XLDA,BSA (+)                                   HEA,XLDA,BSA (-)

                                                                                      TSIA   LIA           LIA  TSIA

                                                                        +       +                      -        -

             +   -                             +   -                                                                   

RV                       TTB                         TSIA,LIA              LIA,TSIA

Urease (-)        Indol (-)              VP (-)                       MR (+)                Sitrat (+)

Uji Escherichia coli

LSTB (+)                                                         LSTB (-)

ECB (+)                                                           ECB (-)

EMBA (+)                                                       EMBA (-)

Indol  (+)          Voges proskauer (-)              Methyl red (+)                Sitrat (-)

Uji Coliform

LSTB (-)                                                               LSTB (+)

BGLB (-)                                                                           BGLB(+)

Uji Sthapilococus aureus

PDA (+)                                             Koagulase

Foto kapang

 

Penampakan Mikroba Di Mikroskop

Sthypilococus aureus                            Bacillus cereus

Basilus                                     Escherichia coli

Khamir                                                 Lacto Basillus

Sthriptococus                                         Clostridium butyrikum

Salmonella                                              kapang

Anoxomat

             KERJA ASEPTIK,PERSIAPAN MEDIUM DAN PERALATAN 

persiapan media

Pupukan yang digunakan untuk menumbuhkan microba disebut media(tunggal) atau media(jamak).media dibedakan atas 3 macam yaitu: media cair yang dapat digunakan berbagai macam tujuan misalnya untuk mengembangkan atau menbiakkan microba,fermentasi dan uji-uji lain,contoh media cair misalnya Nutrien Broth,Glucos Broth dan lain sebagainya.media padat,misalnya Nutrien Agar,Potato Dextorse Agar,yang dapat untuk media menumbuhkan bakteri di cawan sehingga dapat dihitung koloninya.media setengah padat(semi solid) yang mempunyai konsistensi di antara cair dan medium padat.

komposisi medium

 Untuk menstimulir pertumbuhan microba,media harus memiliki komponen-komponen yang di butuhkan microba seperti air,karbon,energi,nitrogen,mineral dan faktor pertumbuhan lain seperti vitamin dan asam amino.microba juga mempunya pH maksimum dan optimum untuk pertumbuhanya oleh karena itu dalam persiapan media perlu dilakukan pengaturn pH sehingga tercapai pH optimum untuk pertumbuhan microba yang diinginkan.

Pembuatan media dapat dilakukan dengan menimbang bahan kimia secara teliti,kemudian mencampurkanya/melarutkanya dalam air suling,mengatur pHnya,dan memasukan ke dalam tabung,dan mensterilkannya menggunakan otoklaf pada suhu dan waktu yang ditetapkan misalnya suhu 121 drajat (tekanan 151b) selama 15-20 menit

medium padat mengandung bahan pemadat seperti agar,gelatin,atau silika gel yang paling sering digunakan adalah agar yang marupakan bahan dari peganggng laut.media yang mengandung agar akan mencair dalam suhu 79-100 drajat,dan setelah sterilisasi media agar akan membeku dalam suhu 42 drajat,media yang disimpan dalam memadat ,misalnya dilemari es dapat dicairkan kembalidengan memanaskan wadah dengan pemanas.media yang akan di inokulasi dengan microba tentu sebelum memadat harus didinginkan terlebih dahulu disuhu ruangan sampai 47-50c.jika media terlalu panas,microba yang akan ditumbuhkan akan mati.

struktur kimia agar terdiri dari galaktan,yaitu polimer dari molekul-molekul galaktosa yang tidak dapat dipecah kebanyakan oleh microba konsenterasi yang digunakan biasanya 1,5% tetapi jika akan dilakukan goresan pada permukaan agar dapat digunakan konsentrasi 1,8-20%sehingga dapat agar yang lebih keras setelah memadat.media setengah padat mengandung agar yang jumlahnya sedikit dari pada media padat biasanya sekitar 0,5% dan sering digunakan uji pengerak microba (motilitas).didalam media agar tidak terdapat bahan makanan untuk microba ,melainkan  hanya sebagai bahan pemadat

Bentuk dan jumlah media

jumlah media yang akan digunakan di dalam suatu percobaan harus diperhitungkan sedemikian rupa untuk meng hindari pembuatan media yang berlebihan karena mahal harganya.jumlah media yang digunakan dapat ditentukan berdasarkan bentuk meda yang di gunakan dan jumlah pekerjaan contoh sbb:

• Agar cawan       :15-20ml/cawan petri 
• Agar tegak         :8-9ml/tabung reaksi
• Agar miring       :6-7ml/tabung reaksi
• Media cair         :9-10ml/tabung reaksi
• media cair berisi tabung durham:9ml/tabung reaksi

MANYEGARKAN KAPANG KAMIR

T virida,Aspergilus sp,niger,A flafous

• panaskan ose dalam pemanas bunsen sampai membara
• masukan ose dalam media yang akan ditumbuhi bakteri,dengan tujuan mendinginkan ose agar pada saat pengambilan bakteri,bakteri tidak mati kepanasan
• ambil bakteri dalam tabung reaksi
• masukan dalam media  TSA dengan mengores secara zig-zag
• panaskan mulut tabung agar tidak terjadi kontaminasi,tutup segera
• setelag itu panaskan ose sampai membara,kemudian simpan di tempat enyimpanan.

MEMBUAT LARUTAN PENGENCER(KH2Po4)

       Untuk membuat larutan pengencer 1liter menbutuhklan 1,25 ml KH2Po4,dengan cara memipet KH2Po4 secara aseptis didekat pemanas bunsen diusahakan agar ujung pipet selalu di dekat api,untuk memipet KH2Po4 sebanyak 1,25 ml dengan menggunakan micro pipet 4 digit putar hingga pada angka 625 pipet 2x ,masukan dalam gelas beker ukuran 1L,masukan aquades sebanyak 1L aduk hingga homogen.setelah itu masukan  larutan pengencer tersebut kedalam tabung reaksi berulir menggunakan dispenset sebanyak 9 ml,step ahir sterilisasi manggunakan autoclave selama  15 menit.

membuat media plate count agar(TPC),potato dextrose agar(PDA),LSTB,braid parker agar base(BPA)

membuat media PCA


Media PCA mempunyai aturan pengunaan 23,5gram per 1liter
contoh: apa bila kita membutuhkan PCA 450ml dengan perhitungan
23,5/1000.450=10,575gram PCA

• setelah kita menimbang PCA dengan berat 10,575gram,masukan dalam erlenmeyer ditambah dengan aqudest aduk hingga homogen
• tutup menggunakan kapas yang telah dibentuk tutup erlenmeyer dan ditutup kembali menggunakan alamunium foil,setelah semuanya selesai secara rapi media di autoclaf untuk sterilisasi selama 15 menit.

membuat media PDA agar miring untuk penyegaran kapang kamir

Media PDA mempunyai aturan penggunaan 39 gram per 1liter

• timbang media yang akan di butuhkan,masukan dalam erlenmeyer ditambah dengan aquadest aduk hingga homogen.
• panaskan media diatas pemanas tanur hingga agar yang terdapat dalam media PDA larut sempurna.
• tuangkan dalam tabung reaksi sebanyak 7mili setiap tabungnya.

• masukan tabung-tabung tersebut dalam autoclafe untuk disterilisasi selama 15 menit.

menimbang media LSTB

• Media LSTB mempunyai aturan penggunaan 39 gram per 1 lier 

menimbang media BPA untuk pertumbuhan kultur sthypilo cocus aureus

• Media ini mempunyai aturan penggunaan 63gram per 950mili

• Dalam pembuatan media ini ditambahkan egg yolk setelah dilakukan inkubasi

• pada perhitungan BPA ini agak sedikit berbeda degan media lain

• contoh: apabila kita membutuhkan media BPA 300mili perhitunganya sebagai berikut,36/1000.300=18,9 gram BPA. 950/1000.300=285mili aquadest 

• masukan BPA dan aquadest dalam erlenmeyer aduk sampai homogen

• inkubasi selama 15 menit,setelah itu tambah dengan eggyolk 15 mili.